IL-33/ST2信号通路与分泌性中耳炎发病的研究进展*

顾潇怡 张茹 朱正华 康诗卉 马兆鑫

分泌性中耳炎是耳鼻咽喉科的常见疾病，其发病率较高。中耳炎反复迁延不愈会导致听力下降，并严重影响患者的言语、智力发育，降低患者的生活质量，加重社会经济负担。该病主要为咽鼓管功能不良伴发上呼吸道感染引起，但中耳炎的发生、发展及迁延不愈的分子机制至今尚未阐明；且临床上针对该病的治疗方案及疗效不一。因此需要研究分泌性中耳炎的发病及其迁延不愈的分子机制，并寻求更具针对性的治疗方案。白介素33(interlenkin-33,IL-33)可诱导大量Th2细胞转移到相应的炎症部位，同时作用于Th2细胞激活IL-33/ST2信号通路，释放IL-4、IL-5等大量相关炎症因子，引起一系列以Th2细胞为主的免疫炎症反应。因此IL-33/ST2信号通路可能参与OME疾病的发生发展，并可能是导致OME迁延不愈的因素。本文对IL-33/ST2信号通路及与分泌性中耳炎发病的研究进展进行综述。

IL-33是1999年Onda等[1]在血管痉挛的犬中由大脑小静脉的高壁内皮细胞胞核内第一次分离出来其DNA，因此IL-33最早被称为“高壁内皮细胞来源的核因子”。Schmitz等[2]于2005年分离出IL-33蛋白分子，并通过序列分析证实该分子C末端和IL-1类细胞因子相似，故将其归为IL-1家族成员，改名为IL-33，又名IL-1F11。

人IL-33基因位于9p24.1染色体位点，其DNA编码含270个氨基酸的前蛋白原形式IL-33，即IL-33原蛋白分子，分子量30 kDa；而小鼠该基因位于19qC1染色体位点，编码266个氨基酸的IL-33原蛋白分子，分子量29.9 kDa。人和小鼠IL-33的蛋白序列相似性仅50%，但空间结构相似性大。IL-33 氮末端1～65位氨基酸形成螺旋-转角-螺旋(Helix-turn-Helix)的空间结构模式。该空间结构内的氨基酸中第40～58位氨基酸是IL-33和核内异染色质特别是染色粒的结合核心序列，其中M45、L47、R48、S49、G50和I53六个位点尤其重要[3]。IL-33通过上述结构与组蛋白H2A-H2B形成的酸性袋状区域共同结合到染色体上，从而调节相关基因的转录。在IL-33羧基末端112～270位氨基酸与IL-1类分子相似且特有β-折叠空间结构模式，该结构区域是IL-33与其受体ST2L的识别位点[2]。

1 IL-33的来源及产生

IL-33在人和小鼠的多种细胞中表达，如免疫细胞(肥大细胞、巨噬细胞、树突状细胞、嗜酸性性粒细胞等)，非免疫细胞(内皮细胞、上皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞等)。但它在不同组织中表达水平不一，在消化道、呼吸及皮肤等与外界接触的黏膜免疫系统中高表达，在淋巴组织、脾脏、胰腺、肾脏等组织中低表达[4]。

Toll样受体(toll-like receptors,TLRs)是非特异性细胞膜表面表达的非特异性免疫识别分子之一，即模式识别受体(pattern recognition receptors，PPRs)。现已发现TLRs家族有13个亚型,即TLR1～13，在人类体内发现10种[5]。TLRs在非特异性免疫应答中占据最重要的地位，属于一型跨膜蛋白，其胞外区同源性较小，因而各个TLRs的配体结构不同，其中LPS、紫杉醇、F蛋白、热休克蛋白60、防御素、纤维蛋白为Toll样受体4(toll-like receptor 4，TLR4)的配体[6]。TLRs胞内区结构与白介素1受体1(IL-1R1)的胞内区相似，称为TLR/IL-R1相似区(TLR/IL-R1 homologous region，TIR)。通过TLRs的跨膜结构可将相关抗原刺激信号传到入细胞内，产生复杂的级联信号反应导致转录因子活化，介导炎性介质基因表达，引起相应炎症介质的合成和释放，从而进一步趋化、激活、活化免疫细胞，启动相关的非特异性免疫和特异性免疫。其中TLR4主要经以下2 条途径进行信号转导：即TLR4-MyD88/IL-1受体相关激酶/NF-κB诱导激酶途径(即NF-κB途径)和 TLR4-MyD88/IL—l受体相关激酶/丝裂原活化蛋白激酶途径，最终导致炎症介质的合成与释放[7,8]。TLRs还能识别体内的“危险信号”(danger-associated molecular patterns，DAMPs)，如受损伤细胞或坏死细胞释放的内源性成分、低钾、尿酸结晶等[9]。IL-33作为细胞因子主要是由上皮细胞产生，变应原、感染、应激反应等因素均可破坏上皮屏障，造成上皮细胞损伤，产生和释放IL-33等细胞因子[10]。在对哮喘的研究中发现，过敏原、污染、病毒等导致肺上皮损伤，从而激活上皮细胞模式识别TLR4，当TLR4信号通路被激活后，IL-33表达可增加[11]。

2 IL-33的活化、分泌、相关信号传导通路及生物学活性

2.1IL-33的活化 IL-33原蛋白分子需经激活才能发挥生物学作用。既往认为IL-33原蛋白经胱天蛋白酶1(caspase-1)裂解后与溶酶体膜融合，才能成为具有生物活性的细胞因子释放到细胞外[12]。还有研究认为caspase-1既有激活IL-33的作用，也有使其失活的作用[13]。另一研究发现IL-33 1～270在细胞外经中性粒细胞丝氨酸蛋白酶、组织蛋白酶G和弹性蛋白酶酶切，产生三种活性形式：IL-33 95～270、IL-33 99～270、IL-33 109～270，大大提高了IL-33的生物学活性[14]。

2.2IL-33的分泌及相关信号传导通路 活化后的IL-33可结合核染色粒调节基因表达，起逆转录作用；也可分泌到细胞外，结合周围及自身的受体，发挥细胞因子的作用。因此IL-33具有抗炎及致炎的双重作用[15]。

2.2.1IL-33的抗炎作用途径 研究发现IL-33以自分泌方式进入细胞核中，通过N末端与NF-κB p65 N末端的Rel同源结构域相结合，减少NF-κB p65与其同源DNA的结合，从而减少p65触发的转录，下调IκBα、TNF-α、C-REL基因表达，抑制IL-33/ST2通路的信号传递[16]。但体内IL-33作为逆转录因子的研究目前尚无报道。

2.2.2IL-33的致炎作用途径 ST2(homolog of sulfotransferase 2)是IL-33的特异性受体，属于IL-1/TLRs受体超家族成员，由Tominaqa等(1989)在BALB/c-3T3细胞中发现该基因，随后证实ST2基因的转录产物共四个亚型：ST2L、sST2(可溶性的ST2，soluble ST2)、ST2LV和ST2V，其中ST2L和sST2含量最多。ST2L是跨膜型膜蛋白受体，分为胞外区、胞膜区、胞内区，由三个细胞外的免疫球蛋白结构域和一个细胞内的Toll/IL-1受体结构域组成。sST2和ST2L的细胞外结构域是共同的，但sST2缺少跨膜和细胞内的Toll/IL-1受体结构域。

在细胞受到刺激后IL-33以分泌泡的形式释放到组织间液中，释放后的IL-33与各类细胞的细胞膜表面受体ST2L结合从而激活IL-33/ST2信号传导通路。当IL-33和 ST2L胞外区的免疫球蛋白结合，且ST2L与IL-1RACP(白介素-1受体辅助蛋白)结合形成受体复合物时,方可将信号传至细胞内，激活衔接蛋白骨髓分化因子MyD88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)和MyD88衔接蛋白(MyD88-adapter like，MAL)，从而调节白介素-1受体相关激酶(interleukin-1 receptor-associated kinase，I-RAK)，I-RAK可促进肿瘤坏死因子受体相关因子-6(tumor necrosis factor-associated factor 6，TRAF6)前体活化为TRAF6。TRAF6一方面可激活丝裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated prtein kinases，MAPK)，进而促进C-JUN的N端激酶活化，最终生成核转录因子AP-1(activation-protein-1)；另一方面TRAF6可使IKB(Inhibition of KB)与NF-κB结合的复合物分解形成IKB和NF-κB。生成的AP-1、NF-κB作为核因子，从胞质内生成后转入细胞核内，与DNA结合发挥基因转录调节的作用[17]。sST2作为负调节因子，与白介素-1受体辅助蛋白(IL-1R accessoryprotein,IL-1RACP)形成的复合物会抑制IL-33的生物学活性，即当IL-33与sST2/IL-1RACP复合物结合后，IL-33不能结合到ST2L位点，抑制了IL-33/ST2信号传导通路[18]。单一免疫球蛋白IL-1受体相关分子/Toll IL-1R8(SIGIRR，TIR8)和ST2L紧密结合后，也可阻断IL-33/ST2信号传导通路[19]。

2.3IL-33的生物学意义 ST2L在Th2细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、NK细胞等细胞表面表达，在Th1细胞表面不表达，各类细胞的IL-33/ST2信号传导系统激活后会产生与其相关的细胞因子，进一步促进免疫炎症联级反应。 IL-33激活Th2细胞IL-33/ST2信号通路后，使之分泌产生IL-4、IL-5、IL-13等细胞因子[20]。IL-33激活嗜酸性粒细胞及嗜碱性粒细胞IL-33/ST2信号通路后使之分泌产生IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-13等[21]；如协同相关抗原可同时促使细胞脱颗粒[22]。IL-33激活肥大细胞IL-33/ST2信号通路后，使之分泌产生IL-6、IL-13、MCP-1、MCP-3、TNF-α等细胞因子[23]；如协同肥大细胞表面的IgE可促使肥大细胞脱颗粒[24]。同时IL-33可作为Th2细胞的诱导介质，可介导细胞的活化和迁徙，使Th2细胞到达相关炎症部位发挥生物学效能; 也可通过诱导化学引物产生，从而促进嗜酸性、嗜碱性粒细胞等炎性细胞局部聚集[25]。

近年来大量研究发现IL-33与多种免疫炎症性疾病相关，如：自身免疫性疾病(风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等)；变态反应性疾病(哮喘、过敏性鼻炎等)；炎症性疾病(肺炎、鼻息肉等)；心肺疾病(心衰、扩心病等)[26～28]。但尚未见在分泌性中耳炎疾病中研究的报道。

3 IL-33/ST2信号传导系统与呼吸系统疾病的相关研究

3.1IL-33/ST2信号传导系统与哮喘的关系 哮喘是Th2细胞占优势的气道阻塞性疾病。研究发现，当LPS激活TLR4/TRIF信号通路产生一系列细胞因子及抗原呈递细胞激活，使CD4+初始型辅助性T细胞活化为Th2细胞，导致Th2细胞反应偏极化，大量IL-3、IL-4、IL-5、IL-13等细胞因子释放[29]；继而IL-4作用于B细胞，IL-3作用于肥大细胞，IL-5作用于嗜酸粒细胞、中性粒细胞等，使之聚集、激活各种炎性介质，增加毛细血管通透性，腺体分泌亢进，致气道呈现高反应性[30]。

哮喘患者血清中IL-33明显高于健康人群[33]。当寄生虫、病毒感染或机械损伤作用于呼吸道上皮细胞，其释放炎症因子IL-33等，诱导Th2型气道免疫反应，引起气管收缩、气道病理学变化[32，33]。研究证明ST2L在Th2细胞和嗜酸性粒细胞表面表达，IL-33可直接促进Th2细胞活化，释放IL-5、IL-13等细胞因子[34]。

3.2IL-33与变应性鼻炎关系 2012年Kamekura等[35]发现变应性鼻炎患者血清中IL-33的含量上升，并且在其鼻粘膜上皮细胞中IL-33和ST2表达增加。杜云艳等[36]于2015年发现变应性鼻炎患者鼻粘膜中IL-33、ST2的阳性细胞数，IL-33、ST2蛋白含量及IL-33、ST2的mRNA表达均明显增加。说明过敏性鼻炎也存在以IL-33/ST2信号传导系统激活的相关免疫反应。

3.3IL-33与慢性鼻窦炎伴鼻息肉(chronic rhinosinusitis with nasal polyps，CRSwNP)之间的关系 Dong等[37]发现鼻息肉患者息肉黏膜内TLR2和TLR4mRNA表达明显高于正常组。丁楠等[38]发现鼻息肉组织内TLR2及NF-κB蛋白表达明显增加，且TLR2和NF-κB表达呈正相关，以及嗜酸性粒细胞浸润程度也和TLR2、 NF-κB呈正相关。根据伴或不伴鼻息肉可分为伴鼻息肉的慢性鼻窦炎(chronic rhinosinusitis with polyps，CRSwNP)和不伴鼻息肉的慢性鼻窦炎(chronic rhinosinusitis without nasal polyps，CRSsNP)。根据是否存在嗜酸性粒细胞(Eos)的优势浸润，可分为诱导Th2免疫应答的嗜酸粒细胞性鼻息肉(ECRS)和诱导较强Th1 免疫应答(与INF-γ、TGF-β表达增加，中性粒细胞性炎症相关)的非嗜酸粒细胞鼻息肉(non-ECRS)。Ishinaga等[39]研究证实相比非嗜酸性粒细胞浸润的CRS组，IL-33mRNA在嗜酸性粒细胞浸润的CRS组鼻粘膜组织中表达明显上调。Douglas等[40]发现术后顽固性CRSwNP患者鼻粘膜上皮细胞内IL-33含量较术后无复发CRSwNP患者成倍增长。目前CRS持续炎症反应的病理生理机制仍未被阐明，推测IL-33及其受体ST2可能是介导CRS，尤其是ECRS患者和顽固性CRSwNP患者鼻粘膜上皮和Th2免疫应答之间联系的关键因子。

4 IL-33/ST2信号通路与分泌性中耳炎

4.1分泌性中耳炎与非特异性免疫及TRLs信号通路的研究 既往在分泌性中耳炎患者中耳积液内检出细菌[41～43]、病毒[44，45]、衣原体[48，49]等病原微生物。儿童OME发病率高，这与儿童咽鼓管解剖的特点和易合并腺样体肥大有关，一旦继发上呼吸道感染，儿童易发生中耳腔细菌感染，并且儿童患者较成人可检出多种条件致病菌。Cho等[48]在OME患者中耳积液中检测到革兰氏阴性菌的组成成分LPS，并发现LPS可导致OME的发病和迁延不愈。Ovesen等[50]用LPS作为炎症刺激因子作用于体外培养的中耳黏膜上皮细胞，发现胞质内NF-κB的表达增加。既往研究观察到OME大鼠模型中咽鼓管及中耳腔内可见细胞膜损害，上皮细胞间隙增宽，管腔内有大量炎性渗出物及脱落上皮，咽鼓管及中耳黏膜肿胀，杯状细胞增多，黏膜下嗜酸性粒细胞、淋巴细胞和中性粒细胞等炎症细胞大量浸润，纤毛排列紊乱及脱落等组织病理改变[50,51]；提示OME发病过程中出现中耳腔黏膜上皮细胞大量受损情况。

上述研究提示，OME发病初期通过机体固有免疫系统发挥防御功能，即当中耳腔内被相关病原微生物入侵后，病原微生物本身携带的PPRs；咽鼓管功能不良、咽鼓管阻塞等产生的病理生理因素导致的中耳黏膜上皮细胞损伤或坏死后释放的内源性成份DAMPs；以及环境中的变应原，三者分别作用于中耳腔局部微环境中，与中耳黏膜内固有的免疫细胞(上皮细胞、巨噬细胞、树突状细胞)表面的TRL结合，激活TRL信号途径，导致固有免疫细胞活化，从而表达和分泌多种前炎症细胞因子(如IL-33、IL-6、IL-12等)。这些促炎因子可促进抗原呈递，使Th1/Th2信号传导系统失衡，还将可能成为固有免疫向特异性免疫反应发展之间联系的桥梁。

4.2分泌性中耳炎与Th2细胞免疫偏极化的研究 如今作为OME重要的免疫学发病机制之一的Th2/Th1细胞失衡机制已受到越来越多的研究证实。赵守琴等在变应原激发成的OME大鼠模型中发现Th2型细胞因子IL-4合成显著增加，Th1型细胞因子IFN-γ相对减少，且IL-4/IFN-γ(Th2/Th1)比值一致性增高，出现Th2细胞免疫偏极化[52，53]。随即他们发现在变应原刺激下的OME大鼠中耳微环境中NF-κB的过度活化，参与中耳微环境Th2细胞反应性增值和分化的调节过程，在OME大鼠变应性炎症反应中发挥重要作用，NF-κB活性状态成为预示中耳局部炎症加重的关键指标[54]。提示在OME的病程中，中耳腔黏膜内的细胞存在IkB激酶活化途径的激活，活化转录NF-κB因子,使之大量释放。且该传导通路的激活与OME局部中耳环境Th1/Th2细胞免疫失衡现象密切相关。因此进一步提示中耳腔黏膜内存在固有免疫细胞的激活，导致大量前炎症因子释放，从而对Th2 细胞的增值、分化及聚集产生影响。

随着IL-33/ST2信号通路的发现及其介导的上皮屏障受损机制的提出，IL-33的产生、作用机制和其参与的呼吸道黏膜上皮内的免疫炎症反应，以及该信号通路在中耳炎的发生、发展及迁延不愈中可能的分子作用机制有待于进一步探索。若IL-33/ST2信号传导通路参与到OME发病过程中，临床则可以通过干预和阻断这一病程对中耳炎进行早期干预，以阻断OME的炎症过程，从而探索新的治疗方向，改善中耳炎患者预后。