遗传性聋基因诊断策略进展*

刘亚兰 桑树山 刘学忠,2

听力损失可以由多种因素引起，其中遗传因素占语前感音神经性聋的60%左右[1]。根据是否伴有其他器官或系统症状，遗传性聋分为非综合征型聋(non-syndromic hearing loss, NSHL)和综合征型聋(syndromic hearing loss, SHL)。在语前聋中，大约70%为NSHL，30%为SHL。按照遗传模式区分，大约80%NSHL为常染色体隐性耳聋(autosomal recessive deafness, DFNB)，20%为常染色体显性耳聋(autosomal dominant deafness, DFNA)，1%为伴性染色体遗传性聋,不足1%为线粒体相关性聋[2]。SHL的临床表现除耳聋外，常伴有其他器官或系统的症状或体征，目前已发现400多种伴有耳聋的综合征[3]。SHL伴随的症状或体征可以帮助综合征型聋的诊断，但是，这些伴随症状可能出现在耳聋之后或者不被发现，从而影响SHL的正确诊断。

遗传性聋具有高度的遗传异质性，相同的临床表现可由不同的基因突变或者同一基因的不同位点突变引起[2];一些基因可同时引起DFNA和DFNB，例如：GJB2、GJB6、MYO7A、COL11A2等；一些基因可同时引起NSHL和SHL，例如：GJB2、SLC26A4、MYO7A、CDH23等[4, 5]。同时，耳聋也具有表型异质性，其表型与耳聋严重程度、发病年龄、疾病进展、累及单侧或双侧、与已知的临床综合征的关联性、听力测试结果以及对助听器或人工耳蜗植入的临床反应有关。耳聋的遗传异质性和表型异质性可能受到环境等因素影响，使耳聋的病因诊断变得更为复杂和有挑战性。因此，本文主要针对遗传性聋基因诊断的最新进展进行综述，为临床医生和科研工作者提供参考。

1 连锁分析

多年来，连锁分析是孟德尔疾病遗传定位和家族聚集性复杂性状分析的主要工具。同源染色体之间可以随机发生交换，距离越远的等位基因相互交换重组的几率越大，距离越近的等位基因相互交换重组的几率越小，因此，相邻的等位基因可以相互连锁成连锁群共同传递给后代。连锁分析就是利用这种原理研究致病基因和遗传标记的关系，进而定位致病基因的位置。通过在大家系中整合有效的共分离标记分子，可以将包含致病突变的遗传区间定位到确定的染色体位置[6]，用于后续多种定位克隆方法。用于连锁分析的遗传标记主要有两种，传统的微卫星即短串联重复序列(short tandem repeat,STR)和单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)标记。由于减数分裂时同源染色体随机重组的限制，这些基因座定位方法通常筛选包含数百个基因的大型染色体区域用于后续定位克隆策略，例如：细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome，BAC)介导的克隆[7]、从检测组织中提取mRNA后制备的cDNA文库[8]和根据表型假定的候选基因的选择和检测[9, 10],或者从已有的耳聋小鼠模型中筛选人类同源基因作为候选基因进行测序[11, 12]，将候选基因排序并依此测序以确定致病突变。

STR连锁分析曾定位了大量疾病相关区域，但由于解析度不够高，通常所定区域长达十数个厘摩。特别是家系代数太少或连锁分析标记密度过低时还可能造成定位区域的漏查或定位分辨率过低。随着国际人类基因组单体型图计划(The International HapMap project)的完成，海量SNP分型数据得以利用，同时基因分型技术也有了极大的发展。HapMap计划之后，SNP高密度、易于自动化和高通量操作、遗传特性更为稳定等特点使其成为新一代连锁分析遗传标记。目前已有基于SNPs的商品化基因定位产品，利用这些SNP芯片，科学家已找到了一些遗传性聋的致病基因。Wang等[13]采用全基因组连锁分析结合全外显子组测序的方法首次在中国非综合征聋家系中鉴定了CEACAM16基因的一个新的错义突变c.505G4A (p.G169R)，进一步的功能研究证实了该突变可能的致病性。Chen等[14]使用Illumina中华8芯片对一个非综合征型聋家系进行连锁分析，找到了15号染色体9.86 Mb长度的致病候选区段(LOD=4.03)，其中未包含已知致病基因；结合随后的全外显子组测序和家系共分离验证，发现DMXL2基因的一个非同义突变为致病候选位点。在家系较大时可用SNP芯片和外显子组测序相结合的策略，这是目前较为广泛采用的研究方法，基于SNP芯片的连锁分析可以提供统计学意义上的染色体定位。有了初步定位的结果，再结合全外显子组的位点筛选，可以在分析阶段将候选目标缩减至个位数位点。

然而，把连锁分析直接应用于遗传性聋的临床诊断存在一定缺陷：其定位通常是cM级别，不适用于难以完成共分离的小家系；其对致病性较弱的突变(如：外显不全等)检测能力较弱，导致连锁分析在耳聋这种异质性较高的疾病中检测致病突变的效率很低。为了提高对致病突变的检测效率和降低成本，基因芯片技术应运而生。

2 基因芯片技术

基因芯片也称为突变芯片，是一种同时检测多个突变的方法。具体原理是将序列已知的突变所在的特定DNA片段作为靶基因有序地固定在载体(如：玻璃片)上，针对靶基因设计特异性的引物，通过PCR扩增技术在样品DNA中掺入荧光标记的双脱氧核苷酸(探针)；然后通过计算机系统扫描探针并获得需要的序列信息[15]。目前，已报道的基因芯片可以检测4～30个最常见耳聋基因的15～300个突变，包括GJB2、 SLC26A4、MTRNR1、MYO15A、OTOF、WFS1、CDH23、TECTA、COCH、POU3F4和TMC1基因[16, 17]。北京博奥生物有限公司和迈阿密大学研究团队最近共同设计的一个DNA流体芯片(Capital Bio Miami OtoArray)，主要针对白种人最常见5个基因的变异：c.35delG, p.W24C, p.L90P, c.167delT (GJB2); 309kb deletion(GJB6); p.L236P, p.T416P (SLC26A4); and m.1555A>G, m.7444G>A (mtDNA)；其有效性和稳定性在160个DNA样品中得到直接测序验证[18]。北京博奥生物有限公司和中国人民解放军301医院研发的晶芯®九项遗传性聋基因检测试剂盒是中国第一个取得医疗器械注册许可证的耳聋基因诊断芯片，目前已广泛应用于临床耳聋基因诊断。此外，吴宏等设计了针对中国人群耳聋遗传背景的具有384个位点的Goldengate高通量耳聋基因芯片，其中，包括240个耳聋相关突变位点(77个显性突变位点及163个隐性突变位点)和144个SNP位点。应用该耳聋基因芯片对465个DNA模板进行筛查,统计分析了芯片Call rate、SNP位点的等位基因频率；对一个非综合征型显性遗传性聋家系进行SNP位点的连锁分析,其结果与传统的微卫星定位扫描方法的定位结果相似,认为该芯片具备初步进行耳聋相关基因的排除定位连锁分析的能力[19]。

基因芯片容易被制定并可以针对特定人群突变频率进行调整。相对于直接测序法，由于同时测序多个基因，突变芯片的费用更低而且周期更短。然而，这种方法只能检测芯片中所包含的基因而不能检测新发突变；在不显著增加成本和时间的情况下，芯片可以包含的突变有限。人类基因组计划完成后，多种高通量测序平台逐步推出，相对于Sanger测序法，这些快速发展的技术提高了孟德尔疾病致病基因检测的效率和准确性，并适用于不符合连锁分析条件的小家系研究，被称为二代测序(next-generation sequencing, NGS)。

3 二代测序(NGS)

虽然NGS技术最初是为研究而设计的，但它很快成为临床上遗传性疾病基因诊断不可或缺的工具。有数百个相关致病基因的NSHL很难通过临床病史和听力学检查做出准确的病因诊断；耳聋基因检测已经成为耳聋患者优先选择的诊断方法并且推荐在体格检查、听力学检查和家族史确定后立即进行[20]；这些策略正在快速应用到临床中。

NGS具有多种不同的形式：靶向捕获测序基因包(panel)、对所有编码外显子测序的全外显子组测序(whole exome sequencing, WES)和对完整基因组测序的全基因组测序(whole genome sequencing, WGS)[21]。据估计，约85%的孟德尔疾病的致病突变发生在编码区或外显子与内含子交界的剪接位点区域，使得靶向富集和MPS方法更为高效[22]。此外，自2008年以来，全基因组测序成本已经降到1 000美元以内，2017年，Illumina 公司推出NovaSeq测序仪，使全外显子组测序价格有望降到100美元。测序技术的日益完善和测序成本的逐渐降低，使得NGS技术更广泛地应用到遗传性疾病的诊断中。

既往认为只需对疑似先天性感音神经性聋或未通过新生儿听力筛查的人群进行基因筛查[23],因而只有约三分之一的耳聋患者在接受基因检测后得到了明确的分子诊断。最近的指南建议对所有未通过新生儿听力筛查的婴儿进行GJB2突变的筛查[24]。虽然有所进步，但仍会漏筛非GJB2突变引起的非综合征型感音神经性聋，以及出生时听力正常、但可能携带引起迟发性聋的基因突变者。

导致遗传性聋漏诊的主要原因有以下三个方面：由于缺乏足够数据无法解释鉴定出的基因变异，测序对象只包含了编码区和剪接位点，以及基因测序只局限于已知的耳聋基因[2]。然而，基因检测技术的进步，如：耳聋靶向捕获测序panel，将越来越多地应用于SHL和NSHL的病因诊断。

自2004年推出首个NGS技术以来，已有1 000多篇与之相关的文章发表，已鉴定出了十多个耳聋基因[25]。第一个用靶向二代测序方法鉴定的耳聋基因是TPRN，该基因位于常染色体隐性遗传DFNB79基因座上，编码一种叫做Taperin的感觉上皮蛋白[26]。从那时起，应用基因座靶向富集技术， SMPX[27]、GRXCR2[28]以及CLIC5[29]等更多的基因先后被鉴定出来，这些新发现的耳聋基因加上之前已知的耳聋基因，为研发全面的靶向捕获测序panel提供了基础。靶向捕获测序panel可以大规模平行地测序数百种基因，与传统的Sanger测序相比，能以更低的成本更快地获得结果。Usher 综合征是常染色体隐性遗传病，Shu等[30]使用199个基因的panel进行高通量测序，发现了USH2A基因上的一个新的突变位点c.13156A>T，该突变与IVS47 + 1G>A突变形成复合杂合突变；经Sanger测序验证，该突变在家系中符合共分离规律。

OtoGenomeTM测序就是靶向捕获测序panel之一，是由Partners Health Care Personalized Medicine的分子医学实验室提供的一种基于panel的基因测序工具，能够筛查70多个与遗传性聋有关的基因，周转时间为8～12周；其在非综合征型感音神经性聋患者个体和人群研究中发挥着重要的作用，如：在犹太人群中识别出了OTOF基因的变异[31]。另外一个基于基因panel的靶向二代测序就是耳科致病性外显子序列捕获(otological sequence capture of pathogenic exons，OtoSCOPE) panel，由美国爱荷华大学于2010年研发[32]。OtoSCOPE能够筛查超过150个已知的导致非综合征型感音神经性聋、Usher综合征和Pendred综合征的基因，其周转时间为3个月。最近OtoSCOPE panel用于研究喀麦隆一个常染色体隐性非综合征型感音神经性聋家系的遗传病因[33]。前庭水管扩大(enlarged vestibular aqueduct, EVA)是一种最常见的先天性内耳畸形，可导致听力障碍，刘亚兰等[34]基于 Illumina®Miseq 测序平台的目标区域捕获高通量测序技术，建立了针对 EVA 三个致病基因(SLC26A4、 FOXI1 和KCNJ10) 的目标区域捕获体系及多重 PCR 富集体系，同时建立基于 CNVplex 技术的目标区域 CNV 检测体系，开发了可同时检测SNV/CNV 的 EVA 基因诊断panel；并在46例中国EVA 患者中验证了该 EVA 基因诊断panel的临床应用价值。

靶向捕获测序panel也被广泛用于检测致病基因变异。最近由迈阿密耳科遗传学研究团队设计开发的Miami OtoGenes panel可以筛查超过180个耳聋相关基因，其周转时间为3～4周，费用为212～305美元[35]。该panel最近被用于对四大洲多种族个体的广泛研究，并确定了非综合征型感音神经性聋的DNA变异谱，并在25%的多发家系和7%的单发家系中发现了致病的DNA变异。从民族多样性的样本中得到的数据对现有的数据库有很大的贡献，并且可以提高某些非综合征型感音神经性聋基因变异致病性的检测和解释能力。基于病例的靶向测序panel也被用于进一步研究已知的耳聋变异和突变，从而加深对非综合征型感音神经性聋的遗传解释。以2015年的一项研究报告为例，该研究在一个非综合征型感音神经性聋家系中发现了PDZD7基因，此前有临床报告认为该基因与Usher综合征有关，但应用一个定制设计的包含151个耳聋基因的靶向捕获测序panel检测该家系，却证实PDZD7是常染色体隐性非综合征型感音神经性聋的真正病因[36]。

随着疾病特异的大规模的靶向捕获测序panel继续应用于耳聋研究以发掘常见的基因变异，这些信息可以进一步按照种族群体或地区进行分层，并被开发成更小、更有针对性的诊断panel应用于临床。在耳聋研究领域，特定种族特异性的基因图谱正在越来越快被鉴定出来。Shafique等[37]报道了巴基斯坦家系中常染色体隐性非综合征型感音神经性聋基因的遗传谱。Ouyang等[38]强调中国人群中非综合征型感音神经性聋中的遗传基础，并在其他特定的耳聋人群中开展了延续性的研究[36, 37]。因此，那些未包含在针对多种群体的基因panel中的罕见基因和突变可以纳入到定制的特异人群基因panel中。例如，非综合征型感音神经性聋中相对罕见的致病基因，如MYO7A、MYO3A、SLC26A4等，非洲裔耳聋患者的携带比例却较高，因此，将这些基因纳入非洲特定人群的基因panel将会有利于这些人群耳聋的病因诊断[39]。

全外显子组测序(WES)已经成为发现耳聋新基因的重要方法。通过针对基因组的蛋白质编码区域的捕获测序，WES减少了全基因组测序(WGS)所需的时间和费用。国内外学者使用全外显子组测序已在非综合征型感音神经性聋中发现了GPSM2和OTOGL等耳聋基因，以及MASP1和DNMT1等综合征型感音神经性聋致病基因。最近，有研究应用全外显子组测序在一个常染色体显性遗传性语后聋的非综合征型感音神经性聋中国家系中发现了SLC44A4基因的致病变异[40]。另一个研究小组在一个5代人均患有综合征型感音神经性聋的中国家系中，应用靶向X染色体外显子组测序发现了GPRASP2基因的一个致病变异[41]。在一个马来西亚家系中应用全外显子组测序鉴定出SLC26A4、GJB2、SCARB2和DUOX2等多个基因的变异，这些基因可能是Pendred综合征的致病基因[42]。此外，全外显子组测序还应用于不适合连锁分析的小家系中，进行纯合子定位(homozygosity mapping)。使用这种方法，研究者们已经在非综合征型聋近亲家系中发现了50多个隐性耳聋基因座，包括在一个巴勒斯坦非综合征型聋近亲家系中发现的GPSM2细胞极性蛋白基因变异[43]。耳聋-甲营养不良综合征(DDOD syndrome，MIM 124480)主要表现为指甲发育不良或缺失，伴随先天性感音神经性聋。Yuan等[44]使用全外显子组测序对2个中国核心三人家系筛查，发现了ATP6V1B2基因的无义突变；基因敲除小鼠模型和体外细胞功能研究进一步证实ATP6V1B2 c.1516 C>T是一个单倍体不足突变。2016年，Cai等[45]使用全外显子组测序在一个中国非综合征型遗传性聋家系中发现了已知POU4F3基因的一个新移码突变c.602delT, p.L201fs。2017年，牛志杰等[46]使用全外显子组测序在一个中国X连锁非综合征型遗传性聋家系中发现SMPX基因的一个新的移码突变c.217dupA, p.Ile73Asnfs*5。

纯合子定位是确定常染色体隐性基因座的另一种方法，尤其适合于近亲婚配的家系[47]和具有相似临床症状的人群[48]。纯合子定位可以将目标基因定位到某一染色体的特定区域，为WES测序和分析提供候选区域并佐证WES数据分析结果。大量研究证实，WES结合纯合子定位是遗传性聋致病基因检测的有效工具。Delmaghani等[49]在一个DFNB大家系中，应用纯合子定位将目标区域定位在1p21.2-1p21.1的大小约2.8 Mb的区域，然后通过WES技术在这个区域发现了致病基因CDC14A；利用类似方法还检测出了GPSM2[43]、OTOGL[50]等耳聋基因。美国医学遗传学和基因组学院(ACMG)将WES筛选出的候选致病基因能够在家系中完成共分离作为致病基因的支持证据[51]，利用Sanger测序在家系其他成员中验证候选致病基因并完成家系共分离已成为验证新变异的常规措施。

目前，NGS技术已经相当成熟，而测序数据的完整解读是NGS技术应用的一大挑战，需要多个不同领域的专家：遗传学家、统计学家、生物信息学家、生物学家和临床医生，以便找出遗传性疾病确切的致病变异[52]，因而，最大的改进之处也在于计算机设施和开发用于生物信息分析的高效准确的算法。最近开发的一种生物信息学pipeline能够进行有效的WGS分析，包括：比对、比对后处理和基因分型，并为后续费时不足2小时的临床解读产生一个变异列表[53]。另一个快速发展的领域是对NGS数据的拷贝数变异(copy number variantion, CNV)分析，由于实验噪声以及在目标捕获和扩增过程中引入的偏差和伪像，使得利用WES数据分析CNV变得非常复杂，并且WES的深度和覆盖率可能并不总是准确地反映真实的拷贝数[54]。最近开发的算法越来越多，旨在解决CNV问题，以减少假阳性和假阴性结果。 CNVs是NSHL的一个特别重要的致病因素，从一项研究中可以确定，约15%的NSHL患者在已知的耳聋基因中至少携带一个CNV[55]。艾吉泰康公司最近推出一款针对汉族人遗传特征制定的AlWholeExome外显子试剂盒，使用中国汉族人DNA标准物质数据作对照，并可分析大于100 k区域的CNV变异。

4 其他耳聋基因热点突变检测技术

除了上述技术，目前应用于临床的遗传性耳聋的基因诊断技术还包括：直接测序法、PCR-RFLP、质谱分析以及荧光PCR法等。目前直接测序法仍是基因诊断的金标准，其得出的结果直观、准确可靠，读长较长，既可发现已知突变，也可发现未知突变，广泛应用于GJB2、SLC26A4以及线粒体12SrRNA的全序列分析，但其通量低，成本较高，不适用于大规模临床推广。PCR-RFLP可以明确地确定突变的有无和位置，但需在突变位点处存在酶切位点或能够引入某种酶切位点；目前已有商品化的基于PCR-RFLP技术的线粒体12SrRNA A1555G突变的检测试剂盒。质谱分析通过使用物理方法(激光)使得样品分子电离，电离的样品在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测，根据测得的样品分子量，进而推知突变位点，主要应用于分析单核苷酸多态性和短串联重复序列，可进行微测序；目前已有商品化的基于质谱分析的20个耳聋基因热点突变的检测试剂盒，但该方法的缺点是分辨率低。荧光PCR技术也被应用于耳聋基因检测，针对突变位点的野生型和突变型，设计一对不同荧光标记的探针，模拟天然DNA的复制，通过PCR扩增，与模板DNA高度特异的结合，收集荧光累积曲线，实时读取定性结果；目前已有商品化的基于荧光PCR的14个耳聋基因热点突变的检测试剂盒并被应用于临床。此外，市面上还有基于导流杂交技术，将PCR和低密度基因芯片技术结合用于检测4个耳聋相关基因的13个突变位点的试剂盒。上述方法各有优缺点，研究人员和临床工作者可以针对不同的研究和临床需求选择合适的技术进行耳聋基因检测。

5 展望

随着高通量测序平台和数据分析的不断完善以及测序费用的降低，基因检测技术已从单基因水平发展到全基因组水平，NGS必将在包括耳聋在内的遗传性疾病的临床诊断和科学研究中发挥更大作用。例如，在耳聋高危家系中进行遗传咨询和产前诊断，可以降低后代耳聋的患病率；然而，对检测结果的分析仍然存在挑战。目前中国还缺乏完整的数据库，生物信息分析和解读时效低、成本高，从生物信息学到NGS诊断还面临很大的挑战。

不同种族或人群携带的遗传信息和遗传性疾病相关的变异信息并不完全相同，例如，目前已经发现100多种耳聋相关的GJB2突变，但中国人群中只报道了20多种；235delC突变在东亚人群中最常见，而35delG突变在欧洲高加索人群中多见[38]。因此，为了充分了解不同种族人群的基因和疾病信息，国际不同机构和研究者之间的合作越来越多，对于耳聋这种异质性较高的疾病，更需要相互合作才能早日了解遗传性疾病的遗传图谱。刘学忠教授与印度、突尼斯、意大利、尼日利亚、土耳其、南非和危地马拉等多个国家合作，收集了342个GJB2突变阴性家系，利用180个耳聋基因的panel(MiamiOtoGenes)检测多种族耳聋基因变异谱[2]，这种模式必将提高相关国家对耳聋的诊断和治疗水平。