TIM-3-Gal-9信号途径在原因不明复发性流产中的研究进展①

卿吉琳 陈治中 谭卫红

(广西壮族自治区人民医院生殖医学中心，南宁530021)

原因不明复发性流产(Unexplained recurrent spontaneous abortion,URSA)是临床诊断治疗的难题，积极探索阐释URSA致病机制和寻求新的治疗靶点与方法成为当前URSA研究热点问题。最近研究表明T细胞免疫球蛋白黏蛋白-3(T cell immunoglobulin mucin-3，TIM-3)可能是原因不明复发性流产的一个新的靶点，本文就TIM-3及其信号途径对URSA母胎界面免疫失衡调控，促进妊娠免疫耐受的研究进展作一综述。

1 URSA研究概况

复发性流产(Recurrent spontaneous abortion,RSA)是指连续3次及(或)3次以上的自然流产，较为常见的疾病，其发生率约1%～2%[1]。复发性流产的发生率正呈逐年上升趋势，因而受到众多研究者的关注[2]。病因主要与染色体异常、内分泌疾病、生殖系统畸形、感染、凝血功异常、抗心磷脂抗体综合征等有关[1]，但仍有50%的复发性流产原因不明，称为URSA，由于URSA发病机制复杂，且涉及基因水平及细胞免疫、体液免疫等多方面因素，使得原因不明复发性流产成为临床诊断治疗的难题[1]。目前对于URSA的机制尚未十分明确，临床对URSA尚缺乏理想的治疗手段，治疗URSA的方法存在较多争议且有限，淋巴细胞主动免疫治疗虽然部分有效[3,4]，但繁琐且存在血液风险。并且URSA患者生活工作质量同时下降，再次发生自然流产的风险性相应增加。因此，积极探索阐释URSA发病机制和寻求新的治疗靶点与方法成为当前URSA研究亟待解决的问题。

当今生殖医学认为，母体孕育胎儿属于同种异体半移植的过程。正常妊娠时，母体免疫系统对半相合同种异体的胎儿不发生排斥，这有赖于胚胎植入时母胎细胞所产生的免疫细胞及其所合成并分泌的抗体和细胞因子之间的相互作用，在体内构成一个复杂的免疫调节网络来维持母胎界面的动态免疫平衡，保持母胎免疫耐受，保证体内正常妊娠成功[5-7]。越来越多的证据表明母体对胚胎的异常免疫反应可致流产发生，母-胎之间的免疫耐受异常可导致正常妊娠向病理妊娠的转变[6,7]。因此，体内免疫失衡及母胎免疫耐受异常是导致复发性流产的重要发病机制[7]。

2 URSA免疫失衡与母胎免疫耐受异常

T淋巴细胞(T lymphocyte)简称T细胞，主要参与体内免疫调控和免疫耐受调节，在器官移植、自身免疫病、肿瘤和感染等方面均发挥至关重要的作用。体内CD4+T细胞可分化为不同的T淋巴细胞亚群,Th1和Th2型细胞是CD4+Th细胞的两个亚型，通过分泌不同的细胞因子参与机体免疫反应[8]。1993年Wegmann等[9]学者首次提出妊娠是一种“Th2现象”，证明Th1/Th2动态平衡对维持正常妊娠起到重要性的作用。研究显示URSA具有与器官移植排斥类似的发病机制，表现为T细胞亚群数量和功能的变化，主要为Th1/Th2型细胞因子平衡的偏移，内在免疫的异常激活，提示URSA与T细胞亚群分化异常有着密切的关系[10]。因此，正常妊娠时Th1/Th2型细胞因子保持一定的平衡，但以Th2型细胞因子占优势[10,11]。Th1型细胞因子不利于妊娠，体内Th1/Th2细胞因子平衡向Th1偏移将导致妊娠失败[11]。对原因不明的复发性流产患者进行治疗，可采用“促使Th1/Th2平衡向Th2型细胞因子为主的模式转化”的策略，从而有利于妊娠期间母胎免疫耐受维持而成功妊娠[12,13]。

CD4+T细胞在特定细胞因子及环境因素作用下还可分化为Th17和Treg新亚群，并参与相应的免疫应答反应；二者不仅在功能上相互对抗，在分化过程中也相互拮抗[14]。研究表明Treg细胞在体内介导的免疫抑制在移植耐受及母胎耐受中起关键作用[14,15]。URSA患者外周血和蜕膜组织CD4+CD25+Treg细胞比例明显低于正常早孕者，淋巴细胞主动免疫治疗后URSA患者外周血与蜕膜中该细胞明显高于治疗前[16]。研究显示URSA患者外周血、蜕膜中Th17细胞及IL-17水平较正常妊娠妇女及育龄期非妊娠妇女均有不同程度升高，IL-23、RORγt等对Th17细胞分化、增殖至关重要的主要细胞因子亦显著增高,表明Th17细胞升高不利于妊娠的维持，提示URSA所产生的这种免疫反应状态倾向于“高Th17低Treg”模式[17,18]。研究表明在正常妊娠中Th17/Treg细胞保持相对平衡，有利于妊娠期间母胎免疫耐受的维持与机体免疫内环境的稳定[18]。一旦Th17/Treg之间的平衡失调，对妊娠结局产生重要影响,将可能导致RSA的发生[18,19]。对原因不明的复发性流产患者进行免疫治疗，可采用“促使Th17/Treg平衡向Treg型偏移的模式转化”的策略[18,19]。因为“Th1/Th2型细胞因子平衡”学说不能充分解释复发性流产的免疫机制，而已证明Th17与Treg细胞对妊娠母胎界面的免疫耐受起重要作用[19,20]。所以Th17与Treg细胞亚群的发现将丰富与发展妊娠时调节母体免疫平衡以及母-胎之间双向免疫平衡机制的理论，使其由“Th1/Th2平衡模式”逐渐发展为“Th1/Th2/Th17/Treg平衡模式”[19]。因此，进一步探索机体免疫动态平衡背后的免疫调控机制对成功妊娠的维持及URSA的治疗都具有重要作用。

3 TIM-3与其配体Gal-9

学者在寻找区别Th1和Th2细胞表面特异性标志时，发现TIM-3选择性表达于分化成熟的Th1细胞表面[21]。TIM-3也表达于活化后的Th17细胞、CD8+和细胞毒性T淋巴细胞表面,TIM-3在CD4+和CD8+上表达失调与病毒感染、自身免疫性疾病和肿瘤疾病密切相关。大量研究表明,TIM-3也表达于树突状细胞、单核细胞和自然杀伤(Natural killer,NK)细胞上,而TIM-3在这些细胞上异常表达与多种疾病如哮喘、自身免疫性疾病和肿瘤疾病等发生发展有关[22]。TIM-3的配体被证实为半乳糖凝集素-9(Galectin-9,Gal-9),与其配体Gal-9结合，通过TIM-3-Gal-9途径产生抑制信号，选择性地抑制IFN-γ分泌，诱导Th1与Th17细胞死亡，负调节Th1与Th17细胞免疫应答，并且影响T细胞的耐受能力[23-26]。因此，TIM-3被认为是一个协同抑制分子，与其配体Gal-9 结合，在体内提供协同抑制信号参与机体免疫调控。

肿瘤免疫和移植免疫领域的相关研究亦提示TIM-3是参与免疫耐受调控的重要分子[27]。胰岛素依赖型糖尿病小鼠模型研究表明封闭TIM-3/TIM-3L通路可导致Th1细胞活化，产生大量Th1型细胞因子，并能加速发病进程[28]。Wang等[29]研究资料显示TIM-3信号通路的激活可增强宿主对皮肤移植物的免疫耐受。另有研究表明该信号通路还参与CD4+CD25+Treg的生成及其功能调节[27]。有研究发现在TIM-3基因敲除小鼠中，因TIM-3基因缺失，受体宿主无法通过拮抗共刺激分子CD40/CD40L或供体特异性输血(Donor specific transfusion,DST)来诱导受体小鼠对移植物的免疫耐受[28]。上述众多研究均提示TIM-3信号通路可产生负性调节信号而抑制Th1与Th17细胞介导的自身和同种免疫应答，并可能调节Treg细胞功能，参与外周免疫耐受形成。

4 TIM-3-Gal-9信号途径与母胎免疫耐受

鉴于TIM-3-Gal-9通路有利于形成外周免疫耐受，TIM-3-Gal-9通路在维持母胎界面免疫耐受的可能作用下开始引起研究者关注。协同抑制分子TIM-3与其配体Gal-9 结合，通过TIM-3-Gal-9途径产生抑制信号，选择性地抑制IFN-γ分泌，诱导Th1与Th17细胞死亡，负调节Th1与Th17细胞免疫应答，在免疫应答过程中起负性调节作用[23,28]。研究表明TIM-3具有抑制Th17细胞分化，促进Treg细胞增殖功能[30]。研究表明Gal-9(+)Th细胞可以通过分泌Gal-9 调控Th17和Treg细胞的增殖和分化[31]。理论上TIM-3及其信号途径有益于正常妊娠偏于Th2与Treg状态，对维持正常妊娠者体内T细胞亚群的动态平衡起重要作用，有助于维持母胎界面免疫耐受，确保成功妊娠。

研究表明在正常妊娠妇女早孕期外周血中TIM-3表达增加，与其配体Gal-9 结合后，传递抑制信号，抑制Th1 细胞，使母胎表面Th1/Th2 细胞免疫反应偏向Th2[32]。最近研究表明TIM-3对 Toll样受体介导的细胞凋亡中蜕膜基质细胞的保护作用和抑制炎症反应，诱导母胎界面Th2型免疫偏倚，以维持妊娠[33]。最新研究表明在母胎界面(胎盘和蜕膜组织)和外周血淋巴细胞中TIM-3表达上调，有助于抑制向Th1的偏移，促进体内Th1/Th2平衡，有助于成功妊娠[34]。而阻断TIM-3 将导致Th1 细胞因子在母胎界面聚集，导致母体对胎儿产生排斥反应。上述研究表明:在正常妊娠过程中，TIM-3-Gal-9 信号通路介导母胎界面Th1/Th2 之间的平衡以维持母胎免疫耐受。

研究表明TIM-3信号通路参与抗原特异性CD4+CD25+Treg 的生成和免疫抑制功能，并且TIM-3(+)Treg较TIM-3(-)Treg更具有免疫抑制功能[35]。并且研究表明TIM-3具有抑制Th17细胞分化，促进Treg细胞增殖功能，然而阻断TIM-3 使IL-17 产生增加[30,36]。有研究发现可溶性Gal-9 将使Th17 细胞分化减少，类似研究表明Gal-9(+)Th细胞可以通过分泌Gal-9 调控Th17和Treg细胞的增殖和分化[24,31]。研究表明与非妊娠者比较，正常妊娠者外周血中Treg细胞上Gal-9的表达水平会增高，血清Gal-9变化与此一致[32]。由此，推测TIM-3-Gal-9 信号通过调控，促进妊娠者体内Th17/Treg动态平衡，参与体内免疫耐受调节，可能在维持母胎耐受中起重要作用。但是TIM-3-Gal-9信号通路在妊娠中对Th17/Treg平衡调控的相关报道甚少，相关调控机制仍需更深入研究。

研究表明正常妊娠者外周血中NK细胞核CD8(+)T细胞上TIM-3的表达水平在妊娠的不同阶段变化不显著，与非妊娠者比较，正常妊娠者外周血中Treg细胞上Gal-9的表达水平会增高，血清Gal-9变化与此一致；同样，与非妊娠者比较，正常妊娠者外周血中的TIM-3(+)CD8(+)T细胞、TIM-3(+)NK细胞及亚群分泌的细胞因子能力和细胞毒活性发生改变[32]。在小鼠早孕模型中TIM-3分子通过其TIM-3-Gal-9途径调控免疫固有细胞诱导母胎耐受[37]。同样，资料显示在妊娠早期NK细胞上TIM-3表达上调，抑制其对滋养细胞的细胞毒性作用，并且在小鼠模型中，研究发现通过TIM-3信号途径，可以调控小鼠子宫NK细胞免疫表型及影响细胞因子的产生，有助于维持母胎界面免疫耐受[38-40]。

而与正常妊娠相比，在URSA的外周血和蜕膜组织中TIM-3与Gal-9的表达异常，并且URSA组CD4(+)TIM-3(+)细胞(Th1细胞)TIM-3 mRNA的表达量低于正常对照组,差异具有显著统计学意义，提示URSA 患者Th1 细胞的激活异常，说明TIM-3-Gal-9协同抑制信号在URSA患者体内降调节，可能参与URSA的发生发展过程，这与URSA存在Th1/Th2 失衡的理论相吻合[41-43]。研究表明在流产患者和小鼠流产模型中研究发现蜕膜自然杀伤细胞(decidual natural killer cells,dNK)表面表达TIM-3减少，并且与TIM-3(-)dNK细胞比较，TIM-3(+)NK细胞分泌产生Th2型细胞因子减少，而Th1型细胞因子增加；同时Gal-9参与dNK调控，提示TIM-3-Gal-9 信号受抑制可能导致其Th1/Th2平衡的改变，从而导致RSA的发生[39]。研究发现URSA患者存在Th1/Th2失衡，URSA 患者血清中可溶性TIM-3(sTIM-3)和Gal-9表达增加，表明可溶性共刺激分子sTIM-3可能参与URSA患者Th1和Th2细胞的分化调控，使Th1/Th2平衡偏向Th1，其机制可能为sTIM-3与Gal-9 结合后削弱TIM-3/Gal-9 信号通路，传递抑制信号，从而参与URSA的发生发展，但确切机制尚未阐明[44]。研究资料表明与正常妊娠组比较，子痫前期患者组的外周血中的T细胞、细胞毒性 T 细胞、 NK细胞和CD56dimNK细胞上TIM-3表达下降，并且子痫前期患者细胞毒性 T 细胞和CD56dimNK细胞的细胞毒性增强，提示TIM-3/Gal-9 信号通路受抑制，可能导致子痫发生[45]。

因此，TIM-3分子及其信号途径对于正常妊娠的固有免疫和适应性免疫应答都起重要作用，可能在维持母胎耐受中扮演重要角色。然而具体调节机制知之甚少。

5 结束语

基于以上阐述，有几点值得我们思考：除了研究在USRA NK细胞上TIM-3表达异常，USRA的免疫微环境中的T细胞亚群上的TIM-3是否异常表达，是数量还是功能异常，还是二者并存？如果免疫微环境中的T细胞亚群上的TIM-3异常表达，又是如何通过TIM-3-Gal-9途径致使URSA免疫失衡作用？URSA免疫失衡能否通过干预TIM-3-Gal-9途径来调节，这种调节作用是由TIM-3信号途径单独直接完成，还是间接参与？这些猜想尚需要深入的探索与研究。因此，TIM-3和其配体Gal-9可能是URSA的两个新免疫调控靶点，可以通过靶向干预TIM-3与Gal-9分子及其信号通路，从而调节URSA母胎界面免疫失衡，促进妊娠免疫耐受，最终改善妊娠结局。