DHCR24表达的调控及其与丙型肝炎病毒感染的研究进展*

张友浦， 王 敏， 罗光华， 张晓膺△

(苏州大学附属第三医院 1心胸外科，2综合实验室， 江苏 常州 213000)

24-脱氢胆固醇还原酶(3β-hydroxysterol Δ24-reductase,DHCR24)可催化链甾醇转化为胆固醇，参与多种脂代谢异常相关疾病(肝病、心血管疾病和链甾醇血症等)的发生发展。丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染导致肝脏脂代谢紊乱以及肝脏炎症，并且可通过增强子诱导DHCR24表达增多[1-2]。近期研究[3-4]发现DHCR24在肝癌细胞的表面呈特异性表达，其单克隆抗体可能发挥靶向治疗作用。由于DHCR24受多种调节因子调控，DHCR24表达的调控对HCV感染疾病的发生、发展可能发挥着重要的作用。

1 DHCR24的生物学特性

1.1DHCR24基因DHCR24基因位点为1p32.3，跨度约46.4 kb，包含8个内含子和9个外显子，编码序列长度为1 551个核苷酸。DHCR24在合成胆固醇的所有细胞或组织中表达，其中在胆固醇丰富的器官或组织(如脑与神经组织)中表达最高，另外，DHCR24在一些分泌类固醇激素的细胞或器官(如肾上腺、睾丸及卵巢)中表达也很高。DHCR24表达的广泛性提示其生理功能的广泛性和多样性。

1.2DHCR24蛋白 DHCR24 mRNA包含约1.5 kb的开放阅读框，编码516个氨基酸的蛋白质，分子量约60.1 kD。多项研究[5-6]证实DHCR24蛋白包含一个具有10个氨基酸片段的保守FAD结合域，这是酶功能所必需的。此外，DHCR24含有p53和Mdm2的保守结构域，对肿瘤发生发展和介导细胞氧化应激的反应至关重要[7]。DHCR24催化链甾醇合成胆固醇是Bloch途径中的最后一步，当DHCR24缺失或失去活性时，链甾醇显著累积。分子动力学模拟和自由能分析研究[8]首次发现U18666A可通过变构调节抑制DHCR24活性，进而降低胆固醇合成。

1.3DHCR24的细胞定位 Greeve等[9]研究发现内源性DHCR24主要位于内质网中，小部分位于高尔基体中，线粒体中无DHCR24分布。另外，Wu等[7]应用免疫定位研究发现DHCR24在基础条件下定位于内质网，氧化或致癌应激可诱导DHCR24定位于细胞核，消除应激原后可逆转，然而紫外或电离辐射应激对DHCR24并无诱导作用，这可能是由于应激性质不同而决定的。Battista等[10]采用免疫荧光及共聚焦实验法研究表明促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropic hormone，ACTH)可诱导大鼠肾上腺皮质细胞中的DHCR24穿梭至细胞核，并且在人前列腺癌细胞系与原代细胞中也可观察到类似结果[11]，而U18666A可阻断ACTH诱导大鼠肾上腺皮质细胞中DHCR24核移位，但在前列腺癌细胞中无作用。关于ACTH诱导DHCR24核定位的具体分子机制有待进一步研究。

DHCR24的表达可通过转录水平和翻译水平的反馈系统进行调控，其中，甾醇、激素、转录因子及生长因子等在转录水平正反馈调控DHCR24的表达，然而，翻译后调控对DHCR24表达发挥负反馈调控作用，主要是通过降解关键限速酶和角鲨烯单加氧酶及抑制甾醇调控元件结合蛋白激活等方式来实现的。此外，不同的表观遗传学重塑也可调节DHCR24的表达。

2 DHCR24表达的调控

2.1甾醇类 甾醇调控元件结合蛋白(sterol regulatory element binding protein，SREBP)转录因子是脂质稳态的主要调节因子。Ramos等[12]研究证实SREBP的活性与DHCR24表达具有相关性。 Horton等[13]发现甾醇水平降低时，SREBP裂解活化蛋白(SREBP-cleavage activating protein，Scap)可将SREBP递送至高尔基体导致其N端水解，活化的SREBP进入细胞核后可结合靶基因中的甾醇反应元件(sterol response elements，SREs)进而增加细胞质中脂质水平[14]。Zerenturk等[15]进一步研究发现DHCR24的近端启动子(-300 /-100)中存在促进甾醇调节的甾醇反应区：1个富含GC的含有2个SREs的区域以及2个邻近的核因子Y辅因子位点。双重SREs可协同作用调节DHCR24的表达。此研究从基因水平上证实SREBP对DHCR24具有直接调控的作用。

2.2激素类 (1)性激素：部分学者推测[16]DHCR24对阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)患者的保护作用与雌激素和选择性雌激素受体调节剂(selective estrogen-receptor modulators，SERMs)的神经保护作用之间可能存在着一定的协同作用。Luciani等[16]研究显示DHCR24编码区上游存在半回文结构雌激素反应元件(half estrogen resposive elements，half-EREs)，并且17β雌二醇、他莫昔芬、雷洛昔芬和植物雌激素与雌激素受体(estrogen receptor，ER)结合并通过half-EREs上调DHCR24的表达，这为雌激素调控DHCR24提供了直接的证据。Benvenuti等[17]证实ERα在雌激素刺激诱导DHCR24表达中发挥主要作用。DHCR24基因启动子序列位于距离翻译起始位点的-383/-112 bp，而half-EREs定位于DHCR24基因启动子上游区的-5 000/-3 000 bp区域[18]。此外，DHCR24还具有对雄激素的应答性，雄激素反应元件(androgen responsive element，ARE)位于DHCR24启动子上游区以及half-EREs序列的下游[19]。进一步研究[20]表明，雄激素与雌激素受体反应元件均位于启动子(-4 384/-2 892)中，雄激素还可通过Scap促进SREBP的活化间接调控DHCR24表达[21]。(2)ACTH：DHCR24是人肾上腺表达最丰富的基因之一[22]。多项研究[10, 23]表明，ACTH促进大鼠和人的肾上腺中DHCR24的表达，DHCR24水平与肾上腺肿瘤ACTH受体基因的表达显著相关。此外，毛喉素(一种腺苷酸环化酶激活剂)可上调DHCR24的表达，进一步表明ACTH上调DHCR24是通过ACTH/cAMP途径实现的。还有研究表明，促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)可通过促黄体激素(luteotrophic hormone，LH)的介导，上调人神经元样细胞的DHCR24表达[24]。(3)甲状腺激素(thyroid hormone，TH)：有学者推测[25]DHCR24可能是脑中TH效应的调节子， T3可促进神经元表型的分化，T3和少量T4显著增加非成熟神经元DHCR24的表达,但在成熟神经元中，DHCR24表达显著降低，且不受TH调节。Ishida等[26]研究显示，TH通过TH受体β(thyroid hormone receptor β，TRβ)于转录水平增加DHCR24基因表达，当甲状腺功能不足或TH抵抗时，肝X受体α(liver X receptor α，LXRα)可代替TRβ行使功能，以维持DHCR24基因的表达。TRβ与LXRα竞争性地与DHCR24启动子中同一反应元件结合并上调DHCR24[27]。

2.3肝X受体(liver X receptor，LXR) 研究[28-29]发现LXR可通过结合其启动子内的LXR反应元件诱导参与甾醇流出的基因(如ABC1)表达，进而降低甾醇水平并维持稳态。利用生物芯片技术研究[30]证实DHCR24是LXR的靶基因，LXR反应元件(liver X receptor response element，LXRE)是位于DHCR24基因第二内含子的一个约1 500 bp的区域，并且LXR激动剂与LXR结合通过LXRE上调DHCR24，证实了LXRE对LXR的应答。人类LXR与TH都需要与类视黄醇X受体(retinoid X receptor，RXR)形成异源二聚体并结合calss direct repeat-4元件才能促进DHCR24的表达[26-27]。

2.4胰岛素样生长因子(insulin-like growth factors -1，IGF-1) 多种神经元表达IGF-1的受体和ER，雌激素可激活IGF-1受体及其信号转导通路。由于DHCR24与雌激素介导的神经保护作用相关，DHCR24可能参与IGF-1的神经保护作用[18, 31]。FNC细胞表达IGF-1受体，并且合成和释放IGF-1、IGFBP2和IGFBP4[31]，其中IGF-1显著上调DHCR24。上述结果提示在雌激素、IGF-1与DHCR24之间可能存在某种联系。总之，IGF-1与17β-雌二醇均可直接刺激DHCR24表达增多，17β-雌二醇增加IGF-1的释放。IGF-1以自分泌环的方式结合IGF-1受体并通过IGF信号通路间接上调DHCR24的表达。最新研究[32]发现，胰岛素可通过SREBP-2上调人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)的DHCR24表达从而发挥抗炎及神经保护作用。而IGF-1与SREBP-2对DHCR24的作用机制仍有待研究。

2.5翻译后调控 多项研究[33-34]证实DHCR24在翻译后受到调控，主要是通过对关键限速酶3-羟-3-甲戊二酸单酰辅酶A还原酶的降解和抑制。通过降解角鲨烯单加氧酶进行通量控制可降低胆固醇的合成[35]。24(S),25-环氧胆固醇可通过3种途径降低细胞胆固醇水平：(1)通过抑制SREBP的激活从而抑制胆固醇合成和摄取；(2)通过刺激3-羟-3-甲戊二酸单酰辅酶A还原酶的降解作用；(3)通过充当LXR的潜在配体促进胆固醇输出[36]。高浓度胆固醇不影响DHCR24活性可排除终产物的抑制作用。24(S),25-环氧胆固醇与链甾醇均具有一个富含电子侧链的脂肪族，暗示可能存在竞争性抑制作用。此外，链甾醇的异构体可抑制DHCR24进一步增强不饱和侧链的甾醇对DHCR24的有效抑制作用，具体的分子机制有待研究。DHCR24具有多个泛素化位点[37]，其泛素化位点的变化是否调控DHCR24仍待研究。DHCR24的磷酸化位点(T110、Y299和Y507)的突变导致其酶活性显著降低[38]。

2.6表观遗传学重塑 多项研究[15, 39]证实甾醇调节区在DHCR24的表观遗传调控中发挥重要作用，如DHCR24基因的甲基化与组蛋白乙酰化均可影响其表达。CpG岛位于DHCR24基因上游区-629/+550 bp，其甲基化水平增加可致DHCR24表达减少；然而，乙酰化组蛋白可结合-1 203/-665 bp之间的增强子进而上调DHCR24。组蛋白脱乙酰基酶抑制剂丁酸钠处理SH-SY5Y细胞后，DHCR24水平呈剂量依赖性增加。肾上腺皮质癌中DHCR24表达与其启动子的甲基化状态也呈负相关[40]。近期一项研究[41]分析并评估了615例婴儿胎盘中DHCR24基因的表达，结果表明DHCR24基因的表观遗传修饰与神经功能以及生理压力显著相关，强调了DHCR24基因对于神经发育具有不可忽视的作用。脂质表观基因组关联研究[42]表明高密度脂蛋白胆固醇水平与DHCR24附近的CpG位点的甲基化具有高度相关性。

2.7外源性化学物质 组成型雄激素受体(constitutive androstane receptor，CAR)与RXR形成异二聚体并结合calss direct repeat-4元件参与DHCR24调节。小鼠CAR的激活可增加血清总胆固醇及肝脏胆固醇生成，部分通过上调肝脏DHCR24介导，在培养的人肝细胞中也观察到CAR通过结合启动子(-1 593)中的calss direct repeat-4元件上调DHCR24[43]。孕烷X受体(pregnane X receptor，PXR)与CAR类似，能够通过结合相同的元件反式激活DHCR24。孕酮可强烈激活PXR[44]进而上调DHCR24表达，然而也有研究表明孕酮是DHCR24活性的有效抑制剂[33]。另外，雌激素和雄激素可激活PXR[39]上调DHCR24。他汀类药物是CAR和PXR的强活化剂[12]，也可上调DHCR24表达[15]，降低总胆固醇。需要更多的研究来解开CAR和PXR对DHCR24调节的复杂性。

2.8其它调节因素 慢性氧化应激可下调神经元DHCR24的表达[45]，细菌脂多糖可通过生成活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)和激活p38诱导巨噬细胞DHCR24的mRNA和蛋白表达下调[46]；橙皮素可活化ER，通过ER和酪氨酸激酶受体信号通路诱导PC12细胞DHCR24表达[47]。长效钙拮抗药双苯吡乙胺可增加大脑中动脉闭塞大鼠同侧丘脑DHCR24的mRNA和蛋白表达[48]。地塞米松可急剧下调种马睾丸中DHCR24表达[49]。

3 DHCR24与HCV感染的关系

丙型肝炎病毒感染常常导致肝脏炎症及内质网的氧化应激[1]。最终导致一系列肝脏疾病，包括脂肪变性、脂肪性肝炎、肝硬化和肝细胞癌等。体内外多项研究[50-52]均发现在HCV感染后DHCR24过表达，而DHCR24低表达时可抑制病毒复制。然而DHCR24表达对于其它肝炎病毒(如HBV)的复制并不重要，具体机制有待进一步研究。HCV感染可能通过增强启动子活性诱导DHCR24表达。 HCV诱导的氧化应激激活转录子Sp1促进其与DHCR24的结合并反式激活DHCR24，然而Sp1结合位点的突变并不参与甾醇调节启动子的激活。在人肝癌细胞株和HCV阳性肝硬化或肝癌患者的研究中[53]发现，DHCR24启动子中的4个多态性与DHCR24表达增加相关联，表明在HCV感染时多因素参与DHCR24上调。HCV感染不影响DHCR24启动子序列的基因多态性。另一项研究[53]发现DHCR24启动子中有4个单核苷酸多态性与HCV诱导的肝细胞癌和肝硬化有关。吴瑞珊等[54]研究表明肝脏疾病患者血清中miR-122的表达水平可作为肝癌早期诊断、手术疗效及预后的评价指标。笔者认为肝脏中DHCR24表达水平极可能与HCV诱导的肝脏疾病进展相关联。

当前研究认为DHCR24过表达在HCV相关肝脏疾病中的作用分为两方面：一方面，HCV的RNA合成发生在脂筏膜结构上，该结构可保护病毒复制的亚细胞器免受RNA或蛋白降解[55-56]，脂筏形成的破坏可削弱HCV复制。由于DHCR24是脂筏形成的重要介质，这可能是DHCR24促进HCV复制另一种机制[57-58]。最新研究[59]认为DHCR24在HCV诱导的氧化应激中持续表达，并通过阻断p53乙酰化及增加其与Mdm2癌基因的相互作用抑制p53活性，进而抑制肝细胞中H2O2诱导的凋亡并增加致瘤性。总之，HCV感染的细胞中DHCR24过表达通过抗凋亡及促进病毒复制以建立慢性感染，并且可能诱导恶性病变。另一方面，多项研究[51, 60]表明过表达DHCR24可保护HCV感染的肝细胞免受H2O2所致的氧化应激损伤，同时，DHCR24敲除可增加细胞对H2O2的敏感性[61]。研究发现，DHCR24可抑制caspase-3活化[9]和/或清除ROS[62]，保护细胞。还有研究[45]发现DHCR24过表达和消除均可保护细胞免受氧化应激损伤，研究者推测其中可能存在2种保护机制：其一，过表达DHCR24以胆固醇依赖性的方式抵抗氧化应激，并认为胆固醇依赖性机制可能涉及促存活因子(如Akt)的激活；其二，低表达DHCR24可通过改变p53的状态和功能增强抗氧化应激能力，应答氧化(和致癌)应激时DHCR24可结合p53的N端并置换E3泛素连接酶Mdm2，从而导致p53的累积及减少细胞存活。

近期研究[3]通过检测395例HCV阳性患者血清中DHCR24自身抗体的含量，发现DHCR24自身抗体对肝细胞癌检测的敏感性高于常规标志物甲胎蛋白和异常凝血酶原。应用针对DHCR24的单克隆抗体(2-152a MAb)研究发现DHCR24在肝细胞癌细胞系的表面上特异性表达，DHCR24可能是HCV相关肝细胞癌治疗的有价值靶标，而2-152a MAb似乎对这种靶向治疗有用[4]。

表观遗传学与翻译后调控开拓了DHCR24反馈调控的新方向，然而表观遗传学与翻译后调控与疾病的关系及具体机制研究较少，对其深入研究有利于全面了解疾病的发生发展、提供新的诊断方法和治疗手段。此外，HCV感染诱导肝细胞DHCR24过表达，其一方面促进胆固醇合成巩固脂筏、清除ROS保护细胞免于凋亡，另一方面脂筏形成有利于病毒复制，并且DHCR24抑制p53活性可增加其致瘤性，可能导致恶性病变。笔者认为机体DHCR24水平处于动态平衡，表达过多或过少均可导致微环境紊乱，并且在特定环境、疾病及其进程中所需的DHCR24表达量均不一样。由于DHCR24在肝细胞癌细胞系的表面特异性表达，DHCR24自身抗体对肝细胞癌检测的敏感性较高，DHCR24可能是HCV相关肝细胞癌治疗的有价值靶标，而2-152a MAb似乎对这种靶向治疗有用。进一步研究DHCR24自身抗体、2-152a MAb与HCV的相互作用及其分子机制有助于为HCV感染疾病提供新的诊断指标和治疗靶点。