伯氏疏螺旋体分型技术研究进展

何志海，杜春红

（1.大理大学公共卫生学院，大理 671000；2.云南省地方病防治所，大理 671000）

伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi sensu lato）为莱姆病（Lyme disease）的病原体，在微生物分类中属原核生物，非光能原核生物界（Scotobacteria）、螺旋体纲（Spirochaetales）、螺旋体目（Spirochaetaleslxt）、螺旋体科（Spirochaetaceae）、疏螺旋体属（Borrelia）、伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi）。该菌贮存宿主为一些哺乳动物和鸟类，经硬蜱叮咬吸血时传染给人体，可侵害人体多系统多脏器而呈现复杂的临床表现，在北半球广泛分布，已经构成严重的世界性公共卫生问题。

伯氏疏螺旋体为稀疏而不规则的左旋螺旋体，常用BSK Ⅱ培养基培养，吉姆萨染色和莱特染色效果好，其分裂繁殖一代需要12～18 h。迄今全球发现21种不同的伯氏疏螺旋体基因型[1,2]。不同的伯氏疏螺旋体基因型引起的临床表征各异，对抗原的免疫原性和疫苗的预防效果有重大影响。分析不同的伯氏疏螺旋体基因型有利于研究伯氏疏螺旋体的地理环境分布、媒介种类和遗传多样性等，并有助于了解莱姆病的发展趋势和预防治疗。

血清学分型和分子生物学分型是目前伯氏疏螺旋体主要分型方法。伯氏疏螺旋体表面蛋白A和表面蛋白C的异质性为血清学分型提供了依据。分子生物学分型方法主要有基因分型和其他分子学分型方法。常用的基因分型方法有核糖体限制性酶切分型、基因间隔区酶切分型、单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNPs）、特异基因PCR、多位点序列分析（multilocus sequence analysis，MLSA）、多位点可变数目串联重复序列分析（multiple-locus variable number tandem repeat analysis，MLVA）等[3]。其他分子学分型方法主要有表面等离子体共振技术（surface plasomon resonance，SPR）、环介导恒温扩增技术（a loopmediated isothermal amplification，LAMP ）和脉冲场凝胶电泳分型技术（pulse-field gel electrophoresis，PFGE）等。

1 血清学分型

血清学分型方法主要依据伯氏疏螺旋体表面蛋白A和表面蛋白C的多态性而设立[4,5]。OspA和OspC在临床上常作为检测抗原，通过ELISA方法和免疫印迹法可检测特异的IgM和IgG抗体，但特异的抗螺旋体抗体一般在疾病二期和三期才出现，不利于疾病早期诊断。OspA是位于伯氏疏螺旋体外膜的一类脂蛋白，已有11种OspA血清型被发现，OspA疫苗在临床1期和2期试验显示其具有良好耐受性和安全性，能引起大多致病基因型的抗体反应[6]。Wilske等[5]对36株从脑脊液分离的菌株进行血清学分型，发现8个OspA血清型，并发现成人和儿童中OspA血清型分布不同。另外OspA血清6型常见于感染B.garinii的蜱，在人感染者中少见，OspA血清2型是引起莱姆病皮肤损伤的主要血清型。有研究表明OspA在媒介蜱体内表达较高，而在动物宿主体内表达较少，提示OspA血清学分型不适合用于临床诊断，而适合于调查媒介蜱携带的病原体。OspC是伯氏疏螺旋体的主要抗原之一。OspA仅将B.afzelii分出一种血清型，而OspC可以将B.aferlii分为4个血清型，可见OspC分型能力比OspA更强。2016年Norek[7]把18株菌株分为3种基因型，其中OspC血清型的G2，G4和G5属于B.garinii，OspC血清型的A3和A8属于B.afzelii。血清学分型有助于莱姆病疫苗的研发、相关临床症状的诊断和螺旋体媒介宿主的分析。但血清学分型的种间区分能力较差，需要耗费大量时间去培养、观察病原体，不利于开展大规模的流行病学调查。OspA和OspC基因多样性受媒介和宿主免疫反应影响[8]，另外蛋白质表达的缺失、反常和菌株传代的突变等原因导致该方法难以应用于实际[9]。由于新的伯氏疏螺旋体基因型被陆续发现，血清学分型方法已难以满足目前伯氏疏螺旋体分型的需求。

2 单基因位点分型

2.1 基因型特异性PCR 设计针对某个靶序列的特异引物，PCR后如果出现特异性扩增带, 则可利用基因序列测序技术进一步确定其基因型。该方法具有特异度高、方便快捷的优点，主要包括5S～23S rRNA基因间隔区特异性PCR、16S rRNA基因型特异性PCR、Fla基因型特异性PCR等。

2.1.1 5S～23S rRNA基因间隔区特异性PCR 该方法是目前国内外公认的常用的伯氏疏螺旋体单基因位点分型技术，常用于菌株的初筛和临床诊断。Vanbik等[10]应用该方法对48株菌株进行初筛，首次发现B.afzelii基因型存在于韩国的二棘血蜱；Wang等[11]采用5S～23S rRNA基因间隔区特异性PCR发现中国新疆地区的亚洲璃眼蜱、刻点血蜱、边缘革蜱、图兰扇头蜱中存在B.Burgdorferi sensu stricto，而B.b.s.s能够导致莱姆病关节炎。说明该方法有助于诊断疾病、研究螺旋体从蜱传染到动物和人的过程、螺旋体在媒介生物的分布和适应性。5S～23S rRNA基因间隔区位于伯氏疏螺旋体基因组唯一的1个rRNA基因操纵子，该操纵子由双拷贝的23S及5S和单拷贝的16S基因组成，具有高保守性，使得该方法具有高特异度，高灵敏度。但是由于5S～23S rRNA基因间隔区序列长度较短且具有高变异区域，使得其不适合系统发育树的分析研究[10]。

2.1.2 16S rRNA 基因型特异性PCR 16S rRNA 基因型特异性PCR技术已被多篇文献报道用于鉴定伯氏疏螺旋体[12,13]。Lee[14]报道了运用PCR对16S rRNA基因进行扩增，对扩增产物进行DNA序列分析，发现了一种新基因型。Fu等[15]采用荧光实时定量PCR对16S rRNA 基因进行分析，发现该方法能特异性地区分出Borrelia burgdorferi sensu stricto、B.garinii和B.afzelii，并且与泰勒虫、巴贝斯虫、无形体、丝状支原体亚种和鹦鹉热衣原体无交叉反应。Borrelia burgdorferi sensu stricto、B.garinii和B.afzelii均可导致人类莱姆病[16]，其中B.b.s.s主要导致关节炎，B.garinii主要导致神经莱姆病，B.afzelii主要导致慢性皮炎。因此16S rRNA 基因型特异性PCR不仅可以探索新的螺旋体基因型，还可早期对临床表现作出诊断。

2.1.3 FlaB基因特异性PCR 伯氏疏螺旋体的Fla基因是高度保守的，有研究表明FlaB基因比起OspA 基因、5S～23S rRNA基因、P66基因有更高敏感性[17]。Norek等[7]基于FlaB基因对B.garinii，B.afzelii和B.valaisiana进行分型鉴定，与RFLP鉴定结果一致。回归热螺旋体表达的FlaB与伯氏疏螺旋体表达FlaB存在差异，使得FlaB基因进行系统进化树分析时，可有效地把伯氏疏螺旋体与回归热螺旋体区分开来，从而有助于疾病的鉴别诊断、系统发育树分析和流行病学调查。

2.1.4 OspA 基因型特异性PCR OspA基因位于伯氏疏螺旋体的线状质粒，是引起莱姆病关节炎的重要因素，另外OspA是螺旋体在硬蜱肠道中定植的重要因素。Potkonjak等[18]基于OspA 基因建立了巢式PCR对4种基因型分型，其中B.afzelii、B.valaisiana和B.garinii为致病基因型。Wang等[11]采用OspA 基因型特异性PCR发现中国新疆地区的亚洲璃眼蜱、刻点血蜱、边缘革蜱、图兰扇头蜱中存在B. burgdorferi reference B31 strain。由于OspA常作为检测抗原，所以该方法优点是有助于研发疫苗和早期诊断临床症状。

2.1.5 OspC 基因型特异性PCR OspC基因位于伯氏疏螺旋体的环状质粒，由于OspC是螺旋体具有侵袭性的重要因素，所以OspC 基因型特异性PCR 有助于判断疾病是否会进一步恶化。蔡婧[19]基于 OspC基因建立实时荧光定量 PCR 方法对3种基因型菌株分型。由于OspC常作为检测抗原，所以该方法的优点是有助于研发疫苗、操作简便，不必电泳检测，灵敏度和特异度高。缺点是无法判断病人的临床分期。

2.2 基因间隔区酶切分型 先采用PCR技术将特定DNA片段扩增出来，再对扩增片段进行酶切, 酶切后的DNA片段用琼脂糖凝胶电泳分析，直接比较电泳条带进行分型，目前较少应用。用于这种分型的特定DNA片段包括16S～23S rRNA基因间隔区、5S～23S rRNA基因间隔区。其中5S～23S rRNA基因间隔区最为常用。

2.2.1 16S～23S rRNA 基因间隔区 Liveris等[20,21]将93株B.burgdorferi sensu stricto菌株分为3型。16S～23S rRNA 基因间隔区的缺点是多样性不足，目前只能够对3种基因型进行分型鉴定。

2.2.2 5S～23S rRNA 基因间隔区 Seunghgun等[22]运用PCR-限制性片段长度多态性分析技术（RCRRFLP）对5S～23S rRNA基因间隔区进行分析，发现了一种新基因。5S～23S rRNA基因间隔区RFLP分析具有快速简便、成本低的优点。缺点是无法鉴定未知带型的菌株，且其结果与测序分型结果的常常不相符[23]。

2.3 核糖体限制性酶切分型 染色体DNA被限制性内切酶酶切后进行琼脂糖电泳后Southern转印，最后用标记的高度保守的rRNA探针进行杂交的技术，目前较少应用。染色体DNA包括16S rRNA 基因、23S rRNA基因，其中16S+23S rRNA基因最为常用。史翠霞等[24]对67株菌株运用16S+23S rRNA基因限制性酶切分析，得到5个基因型。与5S～23S rRNA基因间隔区RFLP分析对比，带型IX对应5S～23S rRNA基因间隔区RFLP的Group GS1，带型V对应5S～23S rRNA基因间隔区RFLP的B.garinii。该方法缺点是只对B.garinii有较好分型能力，并且需要参照标准菌株图谱。

3 多基因位点分型

3.1 多位点序列分析（multilocus sequence analysis，MLSA） 与单基因位点分型技术相比，多基因位点分型技术目前更为常用，其表现出更高的分辨率，更有利于疾病的流行病学研究以及物种进化分析。有研究表明，多位点分型可以纠正单一位点分型造成的潜在分型和进化关系分析的错误。其中最为常用的是多位点序列分析（MLSA）。MLSA为目前国内外最常用的公认的多基因位点分型技术，对于单基因位点无法确定分型结果的菌株，常增加基因位点数目，采用MLSA对菌株进行分型。Richter等[25]建立了7个位点的序列分析方法，从多个位点提供整个基因组信息。该方法可较全面地对伯氏疏螺旋体遗传多样性进行分析，其鉴定伯氏疏螺旋体的效力和细菌全基因组DNA-DNA杂交相当。Margos等[26]采用多位点序列分析，选用管家基因（housekeeping genes）clpA、clpX、nifS、pepX、pyrG、recG、rplB和uvrA共8个位点，系统发育树分析发现一种新致病的基因型Borrelia bavariensis sp. nov.。Nataliia等[27]采用多位点序列分析，选用16S rRNA、the 5S～23S（rrf-rrl）intergenic spacer region、the flagellin、ospA和p66共5个位点，发现一种新基因型Borrelia carolinensis sp. nov.，该基因型宿主为棉鼠和林鼠。Ivanova等[28]采用多位点序列分析，选用16SrRNA、23SrRNA、5S～23SrRNA spacer、FlaB、Osp共5个位点，通过系统发育树发现一种新基因型Borrelia chilensis，该基因型出现在南半球的智利，媒介生物是斯氏硬蜱，宿主是普度鹿和长尾小稻鼠，但其致病性尚未清楚[29]。MLSA综合了多个基因位点的优点，分型效果明显，能发现未知的菌株，并且结果更有说服力。MLSA缺点是实验步骤较单基因位点分型技术繁琐，耗时较长，不能区别不同基因型的混合感染[30]。另外选取的基因需要高保守性，否则分型结果将不准确[8]。

3.2 多位点可变数目串联重复序列分析（multiplelocus variable number tandem repeat analysis，MLVA） 多位点可变数目串联重复序列分析技术是一种利用每个可变数目串联重复序列（variable number tandem repeat, VNTR）位点在不同菌株中拷贝数的差异形成VNTR分辨率，通过VNTR分辨率的可叠加性对菌株分析的基因分型方法。Farlow等[31]于2002年首次将MLVA技术应用于伯氏疏螺旋体鉴定。2013年周鑫等[32]运用MLVA方法将31株莱姆病螺旋体分为4簇，分型结果与多位点序列分析（MLSA）相比，MLSA有3个步长值小于50%，对于部分有争议的菌株，MLVA与MLSA联用可有效对伯氏疏螺旋体进行分型。

3.3 单链构型多态性分析（single strand conformation polymorphism，SSCP） SSCP是一种能迅速鉴定短片段中单个碱基变异的技术。SSCP结合PCR可以发现不同伯氏疏螺旋体基因型之间单个碱基的变异[33]。另外PCR-SSCP可以容易辨别伯氏疏螺旋的混合感染[34]。Krakowetz等[35]运用SSCP联合16S rRNA基因测序，检测出19个单体型，其中8个尚未在美国被报道。SSCP通过产生特殊带型来体现单个碱基的变异。在缺乏类似于GenBank数据库的情况下，SSCP复杂的带型导致其难以对未知基因型进行分析。

4 其他分子生物学分型方法

4.1 全基因组测序分析 全基因组测序技术是目前最为有效的分型技术，常作为最后的参考标准。蒋宝贵等[36]对B.afzelii HLJ01和B.garinii NMJW1进行了全基因组测序，吴琼[37]对B.garinii SZ进行了全基因组测序，研究发现B.garinii SZ基因型有致病性，与B.garinii JW1基因型相比病变表现不一致，与B.burgdorferi B31相比有不同的组织嗜性[38]。Kingry等[1]运用全基因组测序技术发现一种新基因型Borrelia mayonii，研究表明该基因型为致病基因型，感染该基因型的病人有更高水平的螺旋体菌血症，所导致的临床表现和其他基因型不同[39]，从若蜱进入宿主所需时间和B.burgdorferi类似[40]，媒介生物是黑腿蜱，宿主是白足鼠和美国红松鼠[41]。全基因组测序作为最有力的分型技术，其优点是能够提供伯氏疏螺旋体基因组信息，研究种内种间差异及进化规律，阐述伯氏疏螺旋体在分类学上的关系，有利于发现新的表面蛋白和研制新型疫苗，从而有利于莱姆病的预防、诊断和治疗。但其缺点在于需要从媒介或人类标本中分离和培养螺旋体菌株，该过程需要耗费大量时间，不利于临床早期诊断和大规模的流行病学调查。

4.2 多位点酶电泳法（multilocus enzyme electrophoresis，MLEE） 多位点酶电泳法（MLEE）是一种根据酶电泳型差异，将菌株代谢酶进行电泳的分型技术。Balmelli等[42]运用MELL方法将54株菌株分为5个基因型，分别为B.burgdorferi sensu stricto，B.garinii， B.afzelii，B.japonica和Borrelia andersoni。该方法缺点是需要培养大量菌株以获得充足的溶菌产物供分析使用，耗时较长。

4.3 实时荧光qPCR Tm温度分型 Ferdin等[43]基于hbb基因将RT-PCR结合Tm解链温度分型方法运用于伯氏疏螺旋体的分型，发现该方法可以对大多数基因型进行分型，并分别将B.garinii和B.lusitaniae分成2个基因簇，但是无法区分B.spielmanii和B.valaisiana。与MluI-LRFP、MseI-LRFP进行比较，其优点是易于操作，快速简便，能在数小时内得到结果。仝彩玲[44]通过荧光定量PCR熔解曲线上的Tm解链温度较好地反应出recA基因在伯氏疏螺旋体进化过程中GC含量的改变，据此对B.garinii和B.afzelii进行分型。PCR实时荧光定量Tm温度分型优点是快速简便，可实现现场检测分型。

4.4 表面等离子体共振技术（surface plasomon resonance，SPR） SPR利用金属膜和液面界面光的全反射引起的物理光学现象来分析分子相互作用，利用SPR传感系统可以得到生物分子相互作用的信号。于东冬[45]运用该方法对2种基因型菌株分型。SPR 技术优点是能够实时监测反应过程、不必纯化和标记样品。

4.5 环介导恒温扩增技术（a loop-mediated isothermal amplification，LAMP） 环介导恒温扩增技术（LAMP）的原理是DNA恒温扩增。杨吉飞[46]基于伯氏疏螺旋体OspA基因，运用LAMP对3种伯氏疏螺旋体基因型进行鉴定。该方法优点是简单方便，特异度较高，缺点是温度不好掌握、灵敏度较低。

4.6 脉冲场凝胶电泳分型（pulse-field gel electrophoresis，PFGE） PFGE 技术原理是将菌体完全包埋在琼脂糖中，然后加入十二烷基肌氨酸钠、蛋白酶K等化学试剂，将菌体的蛋白质成分完全溶解消化，用限制性内切酶对DNA进行酶切，对酶切产物进行电泳从而对菌株进行分型。耿震等[47]运用PFGE方法对B.burgdorferi s.s.，B.garinii，B.afzelii，B.valaisiana和B.andersonii进行分型，证明PFGE与MLSA和PCR-RFLP有高度一致性。PFGE优点是具有重复性和高分辨能力，能较全面反映伯氏疏螺旋体基因组信息。缺点是需要培养大量菌株以获得充足的溶菌产物供分析使用，处理样本通量低，需要时间长，不利于大规模菌株鉴定分型和流行病学调查。

4.7 多基因位点-电喷雾电离质谱分型 Crowder等[30]运用PCR对gryB、rpoC、rplB、leuS、flab、ospC和hbb共7个位点进行扩增，PCR产物经电喷雾电离质谱（ESI-MS）鉴定后分为5个基因型，分别为B.afzelii，B.garinii，B.lusitaniae，B.spielmanii和B.valaisiana，证明该方法比OspC分型技术分辨程度更好。多位点基因分型结合电喷雾电离质谱分型的方法比起传统的多位点基因分型方法，优点是可以鉴定单个蜱是否混合感染。

4.8 反向线状印迹杂交技术（reverse line blot，RLB） 反向线状印迹杂交技术的原理是PCR产物与固定在Biodyne C薄膜上的特异性探针进行杂交，通过分析所扩序列的差异片段进行鉴定，多个样品通过线性路径对应多个探针，从而实现同时检测多种病原。Tappe等[48]运用反向线状印迹杂交技术和双脱氧测序技术对7个基因型进行鉴定，分别是B.afzelii，B.garinii，B.burgdorferi s.s.，B.bissettii，B.lusitaniae，B.spielmanii和B.valaisiana，RLB缺点是无法鉴别B.garinii和B.bavariensis，需要双脱氧测序技术进一步鉴定。

5 小结

目前伯氏疏螺旋体分型方法较多，优缺点各异，常需联合数种方法对菌株进行分型。随着现代分子生物学技术的发展，基于PCR的各种基因分型技术由于较高的灵敏度和特异度，简便快捷的优点得到广泛的应用。目前国内外公认可用的方法是单基因位点技术、多位点基因分型方法和全基因组测序技术。单基因位点技术一般用于菌株初筛，多位点基因分型方法一般与系统发育树联用对菌株进行分型[49,50]。全基因组测序是分型能力最强的分型技术，但其缺点是需要耗费大量时间分离和培养菌株，一般在证据充分的情况下采用以最终证明结论。血清学分型方法主要用于疫苗研制，较少用于发现新菌株。基因间隔区酶切分型和核糖体基因酶切分型目前已较少采用，其他分子生物学技术，如多位点酶电泳法、表面等离子体共振技术、脉冲场凝胶电泳分型等由于各自均有明显缺点也较少采用。全基因组DNA-DNA杂交被认为是细菌分类的金标准，一般认为当DNA同源性大于70%，ΔTm小于5℃时可以确定两菌株为同种。但由于全基因组DNA-DNA杂交需要已知物种的参考菌株，不适用于培养困难和生长速度缓慢的细菌，另外其结果的重复性难以保证，使得全基因组DNA-DNA杂交运用较少。基因分型技术的缺点是需要选择特定的基因位点，不同的基因位点对基因分型结果的准确性有着不同的影响作用，另外单基因和多基因分型技术只能说明存在新基因型菌株，对新的基因型菌株还需要进行全基因组测序，以了解其表达的蛋白质与其他基因型有何异同，从而为疫苗研发、致病机制等方面作贡献。基因分型技术未来应尽量寻找和选择高保守性的高特异性的基因位点，如cp26和lp54，以便在系统发育树的帮助下体现不同基因型之间的区别。另外随着仪器分析技术的发展，使得伯氏疏螺旋体在蛋白质层面分型成为可能，如通过质谱分析蛋白质的大小，通过核磁共振技术分析蛋白质的结构等，从而更直观更全面地认识该病原体，更有利于相关疫苗的研发和相关致病机制的研究。不同的伯氏疏螺旋体基因型具有不同遗传特性和抗原性[51]，不同的伯氏疏螺旋体基因型与临床表现、地理分布、传播媒介、诊断抗原的选择、莱姆病的流行状况和莱姆病的预防治疗等有密切关系。因此在现有分型方法的基础上，今后仍需要寻找一种快速、高效、便捷的伯氏疏螺旋体分型方法，有效指导伯氏疏螺旋体的预防控制和诊断治疗。