用BAC克隆技术构建转基因小鼠的注意要点有哪些？

答：细菌人工染色体(bacterial artificial chromosomes，BAC)是二十世纪九十年代发展起来的一种基因组文库构建技术，BAC载体遗传稳定性好，不易发生缺失和重组，且容易制备。BAC文库已经在人类基因组计划和基因表达调控等研究领域获得广泛的应用。BAC-DNA含有较大的基因组片段(～200 kb)、较全面的基因调控序列，且我们可通过Red重组技术对BAC-DNA实现定点修饰。BAC-DNA转基因小鼠一个重要特点是它可以使转入的外源基因在转基因小鼠体内不依赖整合位点高效表达。因此使用BAC-DNA制备的转基因小鼠在医学研究领域中仍然具有一定的作用。在利用BAC-DNA制备转基因小鼠时需要注意以下几点：①BAC-DNA的制备需要特殊的质粒试剂盒，推荐使用Nucleobond column方法提纯(NucleoBond® BAC 100 kit)；②制备好的BAC-DNA尽可能进行脉冲场凝胶电泳，确定BAC-DNA的完整性；③注射缓冲液推荐加入Spermidine和Spermine(注射缓冲液：5 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4；0.2 mmol/L EDTA，100 mmol/L NaCl)，以便能保存完整的BAC-DNA；④注射时可以使用环状BAC-DNA，也可使用线性化BAC-DNA，但线性化BAC-DNA的纯化过程比较复杂，相应地增加技术难度；⑤注射时使用较粗口径的注射针和较低的注射压力。