灵长类巨细胞病毒慢性潜伏再激活诱导免疫衰老的研究进展

王宇虹，曲光瑾，肖 冲，邓 巍*

(1.哈尔滨医科大学附属第一医院干部病房，哈尔滨 150001； 2.解放军总医院国家老年疾病临床医学研究中心，北京 100039； 3.中国医学科学院医学实验动物研究所，北京协和医学院比较医学中心，北京 100021)

巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)是一种分布广泛的古哺乳动物病毒，遗传证据表明目前进化的CMV与宿主在哺乳动物物种具有共同的祖先[1]。人类巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)在人群中广泛感染，其全球感染率高达60% ～ 100%[2]。在免疫活性宿主体内，HCMV保持终生持续感染的能力，无论原发性还是复发性HCMV感染通常都是亚临床的[3]。因此，对于免疫功能正常的HCMV携带者，HCMV逃避宿主高水平的抗病毒免疫反应，与宿主终身稳定共存，其免疫逃避机制一直是免疫研究的重要挑战。而对于免疫功能障碍的感染者，HCMV可导致严重的疾病，甚至致死，这对HCMV的疫苗开发和药物治疗提出了重要的挑战[4]。对于免疫衰老的HCMV携带者，病毒的免疫逃避机制，与免疫适应性集中体现的免疫衰老之间的相互作用，则更加微妙复杂[5]。

由于β-疱疹病毒类具有种属特异性，导致HCMV病毒不能在任何动物模型直接研究[6]。每个物种的CMV高度适应其各自的宿主物种，这种高度种属特异的CMV基因组特点，反映了其与宿主密切的进化关联性。鼠类由于不具有CD28丢失性，无法针对其进行CMV感染后免疫衰老机制的研究[7]，因此首选非人灵长类动物进行CMV慢性潜伏再激活诱导免疫衰老的动物模型构建。HCMV最接近的种属是黑猩猩，由于价格、饲养和伦理等问题，并不是一个具有良好可行性的CMV动物模型，所以猕猴CMV(rhesus cytomegalovirus，RhCMV)感染模型是目前研究HCMV感染的最优选非人灵长类动物模型。从宿主角度，感染RhCMV的圈养和野生猴子无处不在；而且RhCMV的感染宿主内也存在和人类一样的慢性潜伏再激活的反复免疫诱导机制[8]。从病毒角度，RhCMV和HCMV基因组的大小、结构和基因组织相似。RhCMV的基因组突变与HCMV基因组的突变具有共线性，近60%潜在致病蛋白与HCMV蛋白具有同源性，这些同源蛋白主要集中在病毒的结构和免疫调节蛋白，G蛋白偶联受体和蛋白参与核酸代谢、DNA复制和转录调控蛋白[9]。故本文从宿主三个免疫状况角度，分别阐述人类巨细胞病毒HCMV和猕猴巨细胞病毒RhCMV的感染免疫研究现状。

1 免疫活性正常的HCMV感染和RhCMV感染的免疫状况

HCMV在大多数健康人的早年原发感染，随即启动终身潜伏感染。在潜伏期间，病毒发生频繁的再激活，反复感染，病毒反复的复制表达，诱导人免疫系统产出HCMV特异性抗病毒免疫清除和炎性反应，使病毒始终处于亚临床状况[3]。宿主的免疫系统能有效的控制病毒传播，但是与绝大多数抗病毒免疫反应可以有效保护宿主免受病毒入侵和再次感染不同，HCMV仍可广泛原发感染、持续终生并且定期继发机会性感染。其自身的免疫适应性和选择性压力使其自身拥有数百万年的免疫逃避优势；另一方面，宿主始终无法清除潜伏在骨髓干细胞的病毒储存池，由此产生了不同病毒株的超级感染[10]。RhCMV广泛存在于种群中，在性成熟的年龄(2.5 ～ 3岁)，血清阳性率达到100%左右，这导致原发性RhCMV研究的成本激增。通过对隔离的幼年恒河猴进行原发感染，证实RhCMV的感染形式与人类很接近。RhCMV在首次感染后建立了终生潜伏感染，病毒的宿主内播散发生在唾液、泪液、尿液、排泄物、精液、母乳和宫腔中[11]。自然暴露实验接种RhCMV感染的健康免疫猕猴临床症状轻微，病理、组化和尸检显示RhCMV在多种组织和器官内多种细胞内有宿主内播散，且与HCMV-DNA阳性细胞分布高度相近[12]。

CMV的免疫逃避机制是CMV持续终生感染的重要机制，包括非常复杂的分子调控网络。由HCMV编码的众多具有免疫调节功能的蛋白，可以干扰宿主细胞的信号转导，活化细胞内和跨细胞运输以及细胞的凋亡[13]。大多数编码RhCMV免疫调节蛋白与HCMV的同源性低，但体外研究显示出相似的功能，HCMV细胞凋亡抑制机制也存在于RhCMV。RhCMV中的UL36(caspase-8介导凋亡，病毒抑制剂)和UL37(线粒体凋亡抑制，vMIA)同源基因的突变能够阻止Fas介导的在HeLa细胞中的细胞凋亡[14]。

HCMV的UL111A开放阅读框架与人IL-10呈现高度同源，HCMV表达病毒源性IL-10是其免疫逃避的重要机制之一[15]。RhCMV中也发现了IL-10表达，呈现出针对宿主体液免疫的抑制性[16]。与HCMV IL-10类似，RhCMV能在猕猴体内表达病毒源性IL-10(cIL-10)，它与猕猴宿主表达的IL-10有25% ～ 27%的同源性，因此，自然感染RhCMV的猕猴中可检测到抗病毒IL-10的抗体[17]。HCMV的MHC-I表达下调机制，是其另一个重要的免疫逃避机制，RhCMV的US2、US3、US6、US11基因组里有相似的基因家族[18]，而啮齿类动物US2 ～ US11基因家族则无类似的免疫逃避机制。RhCMV-US28.5编码一个包含五个同源基因的突变病毒趋化因子受体，与人类HCMV-US28同源，而啮齿类无此基因。灵长类动物特有的七跨膜结构域基因家族，可进一步显示HCMV和RhCMV的同源性[19]。

虽然对HCMV感染的保护性免疫应答的性质尚不完全确定，HCMV诱导的病毒特异性免疫必须被视为宿主保护机制。通过对病毒自然感染史的研究，证实HCMV反复机会性感染诱导的中和抗体和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应，能有效抑制HCMV感染升级和CMV相关疾病发生[20]。RhCMV诱导猴宿主的免疫保护性反应与人类一致。磷酸化蛋白65(pp65)是HCMV免疫反应的主要目标之一，RhCMV-pp65-2定位于细胞核，也是猕猴体液免疫和细胞免疫的目标[21]。在健康猕猴中，RhCMV特异性CTL反应也具有MHC-I限制性，其靶蛋白Rh-IE1和Rh-IE2，与HCMV靶蛋白同源[22]。此外，RhCMV的特异性中和抗体的时间变化曲线和人HCMV也高度相似，且中和抗体的靶蛋白也均为病毒壳表面的糖蛋白(GB)。体外处理克隆的RhCMV GB和HCMV GB其水解产物相近，且存在抗体交叉反应[23]。存在于免疫系统的靶向IE1/IE2，GB和pp65使RhCMV成为研究CMV疫苗的可行模式。

2 免疫功能低下患者的HCMV感染和RhCMV感染的免疫状况

HCMV感染在健康人身上通常无症状，但此病毒是免疫功能不成熟或低下患者的发病和死亡的重要病因之一，也是艾滋病和移植受体机会性感染常见的危及生命的并发症[24]。免疫功能低下时免疫系统已经不能控制HCMV的原发感染或潜伏期的再激活。HCMV先天感染是美国出生缺陷传染病原因的重要原因，仅在美国，与巨细胞病毒病有关的卫生保健费用就超过每年44亿美元[25]。免疫系统功能低下的猕猴也能观察到严重的RhCMV病。实验接种病毒的猕猴胎儿，中枢神经系统发生异常的风险与胎盘的母体IgG转移到胎儿的RhCMV免疫反应呈负相关[21]。监测类似于人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染过程的RhCMV的反应，在携带RhCMV的猕猴上构建猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus，SIV)感染模型，随之进行免疫抑制能够产生特征性RhCMV播散病变，与人类移植受体和HIV患者的HCMV播散方式高度雷同[25]。总之，无论是人类还是猕猴，宿主免疫功能和CMV之间的博弈结果，决定了CMV感染的临床结局。在针对宿主抗移植物的研究中，研究者拟应用抗CD40和CD28抗体延长移植肾的存活时间，有趣的是，在猕猴上应用CD40/CD28抗体后，RhCMV再感染被显著激活，出现播散性CMV病[26-27]，这与下文讲到的“CMV-免疫衰老”悖论相关。

3 免疫衰老的“健康”个体的HCMV感染和免疫衰老的相关性探究

免疫衰老的“健康”老年人，本身即存在一个逻辑悖论。因为衰老的退行性变是一个基因调控的不可逆过程，免疫系统也不能独善其身。在一个健康的老年个体中，免疫功能无异常和年轻免疫活性的免疫系统仍存在很多差异，而健康衰老的定义，目前仍是一个极大的挑战。一方面，持续终生的HCMV反复再感染诱导的免疫反应，可能是老年个体免疫衰老的重要责任病原体。老人宿主外周血中，一半以上的效应记忆T细胞(effector memory CD8+T cells，EM CD8+T cells)均为HCMV特异性的T细胞。这种HCMV特异性T细胞的高度克隆化的累积效应，“压缩”了外周血初始T细胞的数量，使老年个体针对新抗原的识别能力和T细胞受体(T cell receptor，TCR)多样性降低。另一方面，来自相对健康的高龄老人人群的流行病学数据显示，HCMV的反复再激活与预期寿命呈现显著正相关，而不是预测的负相关，因此还有研究者推测HCMV在老年个体免疫衰老的漫长进程中，可能发挥一个“低水平疫苗样炎性刺激”作用，进而避免了老年个体遭受高致病性新病原体感染后的“免疫休克时间窗”，从而降低了衰老个体的死亡率[28]。

4 灵长类动物模型在HCMV诱导免疫衰老机制中的重要性

CMV的进化变异与物种相关性具有平行关系，灵长类动物的CMV基因组与啮齿类动物病毒基因组相比，其相互关联性显著增高。最广泛使用的鼠CMV(MCMV)解决生物学和免疫学的很多基本问题，但是和HCMV基因组有很多不同，MCMV存在许多“非必需基因”[29]。此外，免疫衰老作为一个衰老个体发生的增龄性退行性改变，也是进化压力产生的调适性改变。HCMV诱导的免疫衰老最重要的表型之一是CD28的丢失，HCMV特异性CD28nullCD8+T细胞的增高，是人类免疫衰老风险表型群的独立风险因素之一[30]，鼠的T细胞表面的CD28从不丢失，这降低了鼠模型在免疫衰老中的研究价值[7]。HCMV潜伏于骨髓中无法清除，是HCMV终生反复感染的最重要机制，目前的研究重点已经从HCMV的反复再激活，前推到HCMV在骨髓干细胞的潜伏阶段。既往应用原代细胞和体外细胞系的实验感染，已经证实了分子水平上HCMV基因表达复杂调控的断面网络，这些研究主要集中在MIE基因即时表达调控[31-32]。因为干细胞的HCMV再激活表型的关键在于MIE基因的表达从静止变为触发，细胞转录抑制因子通过组蛋白翻译后的修饰，构建一个染色质结构依赖的转录抑制机制，相关问题还有很多，例如：HCMV长期在髓系细胞中携带，这个潜在的基因组如何维持呢？它们生命的某个阶段，是否发生增殖？HCMV潜在的复制起点是什么？HCMV基因组运输和重新激活高度被限制是如何实现的？最近的研究表明UL84可维持病毒序列，一批具有强大的长期抗凋亡功能的细胞蛋白在潜伏感染的CD34+细胞中上调，提示HCMV拥有一个与众不同的抗凋亡体系[33]。伴随基因表达技术的高速发展，越来越多的证据提示HCMV潜伏其实是一个高度活跃的过程，其中涉及延迟特定基因产物以及定时编排，这些编排时间相关性变化帮助病毒维持潜伏感染，调节HCMV潜伏的骨髓内干细胞的内环境以利于病毒的潜伏。HCMV携带细胞骨髓干细胞的获取，在临床上缺乏实践性。通过在猕猴干细胞获取染色质表型，以及多种组学的同步研究，对明确HCMV的潜伏再激活机制，从潜伏期抑制病毒再激活，从而阻断免疫衰老的核心途径，都是非常有前景的假说[34]。

综上，研发RhCMV作为人类巨细胞病毒的动物模型的时代已经到来。恒河猴动物和细胞模型已应用了许多关于基因组细菌编辑、细胞标记和人工染色体突变的先进技术，由于成本和近亲繁殖淘汰率高的原因，灵长类不会取代小鼠在巨细胞病毒生物学和免疫学的应用，但对于许多重要的科学问题，如疫苗研制、药物开发、潜伏的CMV感染与免疫衰老，非人灵长类正迅速成为首选动物模型。