咽喉反流性疾病相关动物模型研究进展*

宋徽 张延平

咽喉反流性疾病(laryngopharyngeal reflux disease，LPRD)是指胃内容物反流至食管上括约肌以上部位，引起一系列症状和体征的总称[1]。既往有学者认为该病是胃食管反流病的食管外表现，近年来研究证实存在咽喉反流性疾病者并不一定伴发反流性食管炎[2]。目前国内外学者对于该病的基础研究较少，发病机制尚不十分明确，因此，选择和建立有效的LPRD动物模型，不仅有助于进一步了解该病的发生发展，更可为临床治疗方案的选择提供理论依据；为便于建立咽喉反流性疾病相关动物模型，进一步探讨其可能的发病机制，现将国内外LPRD相关动物模型建立的方法综述如下。

1 LPRD相关动物模型建模动物的选择

文献报道的LPRD相关动物模型的建模动物主要选择小鼠、大鼠、豚鼠、兔、羔羊、家猪等[3～6]。由于不同物种间解剖结构及组织形态存在差异，选择最接近人类咽喉结构的实验动物，对于咽喉反流性疾病病理变化及分子机制的研究至关重要。Gill等[7]对小鼠、大鼠、兔、豚鼠、家猪的正常咽喉部组织进行组织学、分子结构、超微结构检查，结果发现只有猪的咽喉部组织存在复层鳞状上皮和假纤毛柱状上皮，且上皮细胞间存在紧密连接复合体的表达，与人类咽喉部结构最相似，认为猪是最合适研究咽喉反流性疾病的实验动物。然而，由于家猪体积较大，饲养难度高，目前多用于离体组织的观察[8，9]。因此，从以上研究来看，如果实验条件较成熟，将猪作为LPRD的活体实验研究是实验动物的最佳选择。

2 动物模型的制备方法

目前, 文献报道的有关建立LPRD动物模型的方法基本都是沿用了胃食管反流病动物模型的建模方法，用于研究胃食管反流时咽喉粘膜的相关变化，一般是通过内源性和外源性两种途径建立动物模型。

2.1内源性方法 主要是通过手术改变胃肠道解剖使胃内容物、十二指肠液或两者的混合物反流，从而导致咽喉炎症，手术方式包括：破坏贲门结构或功能、结扎幽门和近端小肠、插鼻饲管等方法。

2.1.1贲门肌松弛术 Hu等[4,10]为新西兰白兔行全贲门肌切开术，于术后2周和8周对动物进行食管pH监测、喉镜检查、反流体征评分(reflux finding score，RFS)、组织学检查，pH监测术后反流频率、反流指数、最长反流持续时间，可见24小时反流次数明显增加；术后8周行喉镜检查，RFS评分明显增加；组织学检查见术后咽喉部炎症淋巴细胞浸润计数评分、粘膜下腺体增生计数评分明显升高；表明模型兔慢性食管下括约肌功能障碍与反流有关；术后12周取食管和咽喉标本行组织学和电子显微镜检查，发现咽喉部组织出现炎性细胞浸润、细胞间隙显著扩大、桥粒数目减少，并在食管样本中观察到伴有乳头样增生的鳞状上皮。为了在分子水平上进一步研究喉咽部蛋白表达生物学特征，Hu等[11]又通过对Wistar大鼠实施贲门肌肉切除，成功构建了大鼠的反流性疾病模型，并对手术后12周动物近端食管和喉部粘膜进行了形态学和紧密连接蛋白Claudins-3蛋白表达的研究，结果发现在高倍镜下观察上述两个部位组织的淋巴细胞数量增加、Claudins-3表达显著减少，提示反流导致了食管和喉部淋巴细胞的浸润，而Claudins-3表达减少与反流性疾病组织中细胞间隙扩大的形态学特征有关，提示Claudins-3表达可能是大鼠反流性喉炎的敏感指标。

2.1.2贲门置管术 汪忠镐等[12]通过切开SD大鼠胃腔，将扩张管逆向从胃经贲门插入食管，在幽门下0.5 cm处结扎，对照组仅行幽门下结扎而不植入扩张管，两组均向胃腔内注入亚甲蓝1 ml，结果实验组的动物在手术后10小时和17小时死亡，尸检结果显示食管、气道、咽喉、口腔及鼻腔均可见蓝色附着，而对照组尸检显示食管内可见蓝色液体溢出，气道、咽喉、口腔、鼻腔均未见蓝染，提示在胃食管反流中存在胃食管、喉气管反流。Feng等[13]对上述手术方式进行了改进，在内镜下于巴马猪的食管上段和贲门处放置金属网状支架，术后3天取出支架，术后14天行pH监测后取咽喉组织标本行透射电镜检查，结果发现反流次数、反流时间和pH<4.0的反流事件的百分比明显增加，透射电镜检查可见手术组与空白对照组相比，咽喉部粘膜细胞间隙扩大，桥粒明显减少，提示咽喉反流性疾病破坏了喉粘膜细胞间的屏障。该手术方法创伤小，动物耐受性好，术后存活率高，且猪的喉咽部组织结构与人类更为接近，是目前较为理想的动物模型制备方式。

2.1.3幽门缩窄手术 限制幽门排空造成幽门狭窄也是文献报道的另一种制作反流性疾病动物模型的方法。Habesoglu等[14]使用SD大鼠进行该模型构建，实验组腹腔麻醉后，用一段18FR的尼龙导管将幽门环附近的十二指肠在前胃和腺体部之间用不可吸收线结扎，完成模型制作，对照组行假手术，分别于术后1周、4周和12周观察软腭的组织学改变；结果显示与对照组相比，实验组软腭粘膜下腺体增生、上皮下水肿、血管迂曲、肌肉萎缩、炎性细胞浸润、腺体外分泌管扩张，均有显著差异，这些病理变化反映了LPRD与气道堵塞的关系。Shimazu等[15]用丝线将Wistar大鼠胃底部结扎减少胃容积，并将Nelaton软导管套于幽门处以减缓胃排空，观察术后2周至20周动物胃食管大体形态改变，并取咽、喉、气管、肺、食管行组织学检查，术后第8周见下咽部粘膜增厚，炎性细胞浸润，术后12周可见成纤维细胞增殖、胶原纤维沉积，术后第16周胸段食管神经细胞、杓状软骨和肺组织中发现炎性细胞浸润，术后第18周可见下咽部粘膜固有层乳头增生，毛细血管扩张增殖，证实胃酸反流所致的炎性反应已延伸至咽喉部。

2.1.4鼻饲管置管术 插鼻饲管是临床上对于咽喉及胃肠疾病治疗常用的操作，很多患者存在反酸、嗳气及咽喉不适，目前对该症状出现原因的研究不多见。Marinho等[16]通过对大鼠的研究发现这种鼻饲管引起的不适症状与反流导致的咽喉炎症有关，他们通过麻醉动物后将10～13 cm长的鼻饲管经Wistar大鼠前鼻孔、鼻咽部插入胃内，1周后处死动物检测动物喉组织中过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性、局部炎症及胶原纤维沉积情况；结果显示鼻饲管组动物喉部组织中MPO活性显著增加，粘膜下可见中性粒细胞、巨噬细胞以及淋巴细胞等炎性细胞浸润，可能与鼻饲管影响食管括约肌功能造成的反流性炎症有关，而105J/cm2的红外激光可以减轻上述组织反应。

上述内源性方法制备的均为胃食管反流动物模型，观察胃食管反流的食管外表现，其优点是可以研究反流疾病的急性病理生理，但也存在一定的局限性，如：动物需要很强的耐受性方可接受手术，手术者也需要有较高的手术技巧；动物常死于各种手术并发症，影响动物实验的开展；因此，内源性LPRD动物模型制作方法的应用也受到一定的限制，同时该方法对非酸反流等发病机制不能做很好的解释。

2.2外源性方法

该方法主要是通过向活体动物咽喉部组织灌注胃酸、胃蛋白酶、胆盐等，利用上述物质的化学性刺激损伤咽喉粘膜上皮，导致炎症和溃疡，从而构建LPRD模型。

2.2.1酸和胃蛋白酶 Koufman等[17]于1991年最先使用了酸和/或胃蛋白酶，每周3次直接涂抹于猎狗声门下喉部粘膜创面，观察喉部创面愈合的情况；2周后处死动物，结果发现接触酸的组织愈合时间比对照组延长，而接触酸和胃蛋白酶的组织不愈合；唾液中的硝酸盐一旦与胃酸接触，可产生亚硝胺类物质，可诱发食管上皮或上消化道上皮恶变，认为该机制可能与无烟酒嗜好但有反流者上消化道鳞癌的发生有关。

由于使用的动物种类不同、方法各异，获得的结果也不尽相同。Durkes等[18]为了研究酸和胃蛋白酶对声带上皮结构的影响，用内镜喷洒导管将酸和胃蛋白酶直接滴在每侧声带膜部，反流组喷洒pH3～4 的酸化胃蛋白酶(1.0毫克/毫升)1.5毫升，对照组则喷洒1.5毫升生理盐水，每周重复 3 次，共持续4周，第12次操作后采集喉组织标本；观察发现实验组和对照组声带组织病理学改变、弹性纤维及胶原纤维的数量和形态、相关蛋白表达(上皮屏障蛋白、上皮离子转运蛋白及促炎症因子)等均无明显差异，上皮细胞超微结构、细胞间隙、微嵴高度无明显改变，结果提示健康的声带上皮能够抵御酸性胃蛋白酶的侵袭。

2.2.2胆盐 脱氧胆酸在Barret食管(食管下段的鳞状上皮被柱状上皮覆盖)发生中起重要作用，研究提示脱氧胆酸可以通过NF-κB途径诱导DNA损伤和凋亡抵抗，而鹅去氧胆酸可以引起喉粘膜发生炎症浸润。为探讨胆盐在下咽癌发病机制中的作用，Vageli等[19]采用塑料饲养管将不同pH值、伴有或不伴有鹅去氧胆酸的脱氧胆酸液体滴入小鼠下咽和食管上端，每天两次，45天后行组织学检查(观察上皮异常增生、上皮厚度)、免疫组化(p- NF-κB)、免疫荧光[rp-NF-κB (S536)、Ki67、ΔNp63、CK14、E-cadherin、β-cateni及p-STAT3 (Tyr705)]检测，结果提示与单纯酸暴露和其他对照组相比，免疫组化和自动定量分析都显示暴露于十二指肠液体的小鼠下咽粘膜出现明显的NF-κB活化和癌前改变，癌前改变组织中细胞增生因子Ki67、CK14和ΔNp63表达增加, 细胞粘附分子 E-Cadherin减少，脱氧胆酸、鹅去氧胆酸和酸性胆盐暴露组动物出现了咽喉上皮的异常增生或轻度不典型增生，脱氧胆酸暴露的动物下咽粘膜出现了中度不典型增生，该结果支持十二指肠成分中的胆酸或胆酸成分诱导了小鼠上消化道鳞状上皮分子改变和早期癌前病变，进一步为反流性疾病是导致上消化道鳞状上皮恶性肿瘤的学说提供了实验依据。

外源性方法的优点是操作简单，动物存活时间长，可以长时间观察，但也存在局限性，一是灌流液与活体反流物完全不同，二是LPRD是一个涉及多方面因素的长期慢性过程，单纯通过化学刺激损伤咽喉粘膜难以完全解释LPRD的发生和发展，只能用于研究咽喉和食管粘膜损伤和防御机制。

2.3离体实验 上皮细胞位于声带最外层，在保护声带固有层防止机械、化学、生物侵蚀等方面发挥重要作用[20],因此，喉部离体组织实验多采集声带上皮组织，进行细胞学及组织学检查。Erickson-Direnzo等[8]采集猪离体声带上皮并给予丙烯醛、盐酸、过氧化氢等干预后，对声带上皮细胞行Hoechst/Ethidium荧光染色检查细胞膜结构完整性，MTT法检测细胞代谢活性，结果表明盐酸和过氧化氢干预组细胞膜完整性及细胞代谢活性下降，细胞生存能力降低，组织学检查见上皮组织脱落、糜烂、水肿、分离、间质水肿及空泡化，其维持屏障功能的能力受损。

细胞跨膜电阻是一种广泛用于检测食管、声带等复层鳞状上皮屏障功能的指标，阻力增大表明屏障功能增强，降低表明上皮渗漏增加、屏障功能受损[21]。Erickson等[22]模拟酸性反流，将猪离体声带上皮分别置于酸性蛋白酶、酸和蛋白酶中，结果显示，酸和酸性蛋白酶组暴露30 min后即可出现细胞跨膜阻力降低，表明声带上皮细胞跨膜电阻可能对早期反流相关的上皮改变更为敏感，上皮屏障渗漏的增加导致反流事件对声带上皮和固有层的进一步破坏。

随着电生理研究的深入，声带上皮细胞离子转运通道逐渐成为近年离体组织研究的热点。Erickson-Levendoski等[23]将猪声带暴露于pH3的盐酸、硫酸和胃蛋白酶中，60 s后盐酸和硫酸组的声带离子转运一过性快速增加，且与碳酸氢盐的分泌有关。Durkes等[24]用类似的方法证实了碳酸氢盐的分泌可能有助于增强声带抗酸的能力，这一结果为碳酸氢盐作为一种新型制剂用于治疗咽喉反流性疾病提供了理论依据。

3 问题与展望

文中所述动物实验采用不同种类的动物和方法对LPRD的病因、机制及病理生理变化进行了深入的探讨，为该病的临床治疗提供了有价值的理论依据；但上述动物模型都是LPRD与胃食管反流共存或非生理性反流，同时未涉及神经、情绪、应激等相关因素对发病的影响，在研究LPRD的发病机制、治疗干预等方面还存在很大的局限性，因此，构建单纯生理性LPRD动物模型将有助于对LPRD更进一步的研究。

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