铁皮石斛原球茎组织培养研究进展

张 鑫

（天津创世生态景观建设股份有限公司，天津 南开 300000）

铁皮石斛（Dendrobium oきcinaleKimura et Migo）是兰科（Orchidaceae）石斛属（Dendrobium）多年生附生草本植物，因其老茎外呈黑色，又名为黑节草，是名贵中药，居“中华九大仙草”之首，所含的主要成分为石斛多糖及生物碱，另外，还有酚类、菲类、芪类、倍半萜类及香豆素等。现代药理研究证明石斛多糖具有抗肿瘤、增强免疫力的功能。但由于铁皮石斛生长环境特殊，以及长期采挖，自然资源日趋枯竭，已被国家列为重点保护的野生药材。从20世纪中期开始就有关于铁皮石斛的研究，主要涉及组织培养方法、有效成分含量和药理作用方面的研究。随着研究的深入，发现铁皮石斛在组织快繁过程中存在一些问题，例如通过组培生产出苗的成本过高，幼苗移栽成活率低，工厂化生产效率低。鉴于以上问题，现在对于铁皮石斛原球茎的研究日益广泛，铁皮石斛原球茎是由铁皮石斛种子通过无菌培养诱导繁殖形成的。它是种子萌发过程中，原胚萌动膨大，突破种皮后形成的浅黄色小圆锥形胚性组织。以铁皮石斛原球茎为材料进行组织培养，通过改变培养基条件，可使铁皮石斛原球茎生长旺盛，繁殖率高，具有较好的开发前景[1]。原球茎在培养基上可以直接分化成幼苗，也是制备人工种子的材料，使幼苗移栽成活率低的问题得到了解决；原球茎中也还含有同石斛苗相同的药用成分，通过大规模培养来提取，同样可以满足药材市场对铁皮石斛的需求。

本文根据有关铁皮石斛原球茎组织培养技术研究方面进行了综述，以期为解决铁皮石斛资源短缺问题提供一种有效方法。

1 培养基与激素

培养基是组织培养过程中培养材料吸收营养的来源，是决定组织培养成功与否的关键因素。而植物激素在植物组织培养过程中同样起着主要作用，影响植物的生长代谢。研究证明，铁皮石斛原球茎能够通过固体培养基培养，从最终的效果来看，比如产量和多糖的含量，悬浮培养效果更加理想[2]。其原因可能是液体培养不仅可以使植株更加全面的接触到培养基，植株可以吸收较多的营养物质，有利于细胞的生长和再分化[3]。而且在液体悬浮培养时，可以用细胞培养技术进行生理生化调控，该技术的应用可以大大提高控制能力，经过悬浮培养的原球茎多糖含量可达20.1%，野生铁皮石斛中的含量也不过如此[4]。魏小勇[5]建立的铁皮石斛原球茎悬浮系，原球茎分散性好、整齐均一，为铁皮石斛大规模培养开创了新途径，同时，该研究组发现在培养基中添加0.5 mg·L-1ABA预先培养30 d，原球茎的质量提高、同步性更好，可以大规模增殖铁皮石斛的原球茎，用于制备人工种子。莫昭展等[6]的研究结果表明在改良MS中加入0.5 mg·L-1脱落酸，进行液体振荡培养，原球茎增殖的效果比较好。苏钛等[3]用正交设计方法研究了对铁皮石斛原球茎具有高效增殖影响的激素（6-BA，NAA，KT，马铃薯汁）以及配比，结果表明，原球茎在1/2MS+6-BA2.0 mg·L-1+NAA1.0 mg·L-1+KT0.5 mg·L-1+3%糖的培养基上，以液体悬浮培养，原球茎50 d增殖达49.032 g。随着工厂化育苗的发展，人们越来越重视经济效益，采用其他材料来代替培养基的部分成分，以期减少生产成本，李思梅等[7]通过研究沼肥以不同比例替换铁皮石斛原球茎增殖培养基中部分营养成分后，认为沼肥按一定比例替代培养基中的部分营养成分，可以促进原球茎增殖，并验证了沼肥以10%的替代比例替代大量元素为最佳。苏江[8]认为培养基的渗透压对铁皮石斛原球茎的生长有重要的作用，并以无菌铁皮石斛原球茎为材料，通过添加不同浓度的甘露醇以调节其渗透压，得出结论：添加低浓度的甘露醇可促进铁皮石斛原球茎生长及增加多糖含量，而添加高浓度的甘露醇能明显抑制铁皮石斛原球茎生长及降低多糖含量，而且当甘露醇质量浓度为20 g·L-1时，随时间的推移，原球茎活力、生长量、多糖含量和多糖产量总体呈上升趋势。

2 碳源和氮源

细胞干物质中的主要元素是碳，碳元素是构成细胞骨架的重要成分，因此在培养基中添加一定的碳源是必要的[9]。在铁皮石斛原球茎生长过程中，培养基中的糖提供植株生长所需要的碳源。在培养结束后，对培养基中的成分进行研究测定，发现添加的糖分几乎全被植株吸收利用。在糖消耗的同时，原球茎干重逐渐增加[2]。何铁光等[10]研究，添加不同的糖类物质作为碳源，发现蔗糖和葡萄糖能够被优先利用，对原球茎生长速度和多糖积累含量的影响明显高于乳糖和果糖。同时该研究组还研究了不同蔗糖浓度对铁皮石斛原球茎生长速度和多糖积累的影响，对结果进行分析，铁皮石斛原球茎生长的最佳蔗糖浓度和多糖积累所需的最佳蔗糖浓度是不同的。综合各种因素考虑，如原球茎干重、多糖含量、生产成本等，实际生产应选取30 g·L-1的蔗糖浓度。

氮源的浓度对细胞的生长发育和代谢产物的形成有着重要的作用。培养基中的氮元素分为硝态氮和铵态氮，其NO3-/NH4+的比值的大小对原球茎的生长代谢有着相当大的影响。韦晓新等[11]研究表明，当氮源浓度范围控制在为30～60 mmol·L-1、NO3-/NH4+分子比为 40∶20时，能够促进原球茎生长，且高浓度NH4+会对原球茎生长产生抑制，因此在配培养基中应注意控制NH+4的浓度。宋经元等[12]以原有的研究基础通过利用正交试验设计来研究不同种类和浓度的氮源对铁皮石斛原球茎生长增值的影响。得到的结果如下，硝态氮有利于铁皮石斛原球茎鲜重和干重的增加；而铵态氮仅有利于铁皮石斛原球茎鲜重增加，通过试验还可以得到，无论对于鲜重还是干重，硝态氮和铵态氮的影响均不存在互作，培养基的最佳组合为：67-V培养液+30 g·L-1蔗糖+200 g·L-1马铃薯提取汁+100 mg·L-1（NH4）2S04+800 mg·L-1KNO3。李巧自等[13]以硝普钠（SNP）为一氧化氮（NO）供体，研究了不同浓度的外源NO对铁皮石斛原球茎生长、叶绿素含量、蔗糖合成酶（SS）活性和多糖积累的影响，认为低浓度的SNP有利于铁皮石斛原球茎的生长，而高浓度的SNP可以促进多糖的合成。

3 金属离子、真菌和天然附加物

培养基中的金属离子来源于无机盐中，植物从培养基中吸收金属离子，以合成自身生长发育所需的物质，例如核酸、酶以及蛋白质等。金属离子同样也影响原球茎的生长代谢。林从发等[14]通过对5种金属离子进行单因素实验得到，影响原球茎生长增殖的顺序为 Mg2+＞Fe2+＞Ca2+＞Mn2+＞Zn2+，并对3种天然附加物（马铃薯、苹果和香蕉）对原球茎增殖的影响进行研究，结果表明：3种附加物对原球茎增殖影响差异极大，马铃薯和苹果更有利于原球茎的增殖，该培养基上的原球茎长势良好，颜色鲜绿，生长参数平均分别达到10.6和9.3，而香蕉则不利于原球茎的增殖，原球茎在该培养基上增殖缓慢，颜色发黄，最终死亡。得到原球茎增殖的最佳培养基1/2MS+10%马铃薯汁+3%蔗糖+NAA0.5 mg·L-1（含Ca2+2 mmol·L-1、Mg2+1.0 mmol·L-1、Mn2+0.1 mmol·L-1、Fe2+0.1 mmol·L-1、Zn2+0.03 mmol·L-1）。研 究 表明适宜浓度的锗有利于悬浮培养的原球茎生长发育，通过在原球茎生长的培养基中添加适宜浓度的锗发现，原球茎的鲜重，可溶性蛋白和叶绿素含量明显增加，而且促进超氧化物歧化酶（SOD），过氧化氢酶（CAT）活性升高，过氧化物酶（POD）的活性下降。因此适当浓度的GeO2（5 mg·L-1）对原球茎的生长有促进作用[15]。

铁皮石斛是一种与真菌共生的兰科植物。真菌促进其种子的萌发并与之形成菌根而促进其对营养物质的吸收[16]。从野生的铁皮石斛中可以分离出相应的真菌菌株，而真菌添加物是通过将原始菌株进行分离、发酵培养并将得到的发酵液与菌丝体混合，然后匀浆灭菌后得到的。侯丕勇等研究发现真菌添加物不利于原球茎增殖分化[17]。宋经元等[12]利用从白兰科植物体内分离的14种原始菌制的相应的真菌诱导子，发现其对原球茎的鲜重和干重没有显著的影响，这14种诱导子对原球茎的增殖都有不同程度的抑制，这与侯丕勇的研究结果是一致的。研究表明，活体真菌MF24在适宜的环境下能够与原球茎共培养，而且会对原球茎的次生代谢水平产生影响[18]。在原球茎悬浮培养的后期加入MF24发酵制备的诱导子会促进原球茎多糖含量的积累[19]，并有利于原球茎的增殖生长，影响生物碱的合成[20]。在铁皮石斛内生真菌的研究中，获得了对组培苗的生长呈现不同影响的两株内生真菌DCN-1和DCN-3，喻静[21]通过试验得出菌株DCN-1对组培阶段和移栽后的组培苗和原球茎的生长无明显影响，菌株DCN-3会导致组培阶段的植株苗枯萎甚至死亡而对移栽后的组培苗影响不大，但抑制原球茎的生长。符合之前研究得出的结论，真菌添加物不利于原球茎的增殖分化。

在原球茎组织培养过程中通常添加香蕉汁、土豆汁、芋头汁等天然附加物，这些物质中一般含有有机营养成分并对原球茎的诱导、增殖和分化有重要作用，天然附加物的研究是铁皮石斛原球茎最重要的一个方面。张治国等[22-23]在培养基中分别添加了马铃薯、荸荠和香蕉三种相应的植物提取液来观察其对原球茎的生长状况的影响，得出马铃薯的增殖系数最高，香蕉的最低而且原球茎生长情况不良；未添加天然附加物的对照组的原球茎未分化，增殖比较明显；而添加马铃薯的分化状况也是很明显的，分化成的幼苗颜色鲜绿，生长健壮；得到的结论为原球茎增殖时不添加天然附加物，原球茎分化时添加马铃薯的提取液。包英华等[24]为探讨铁皮石斛原球茎的培养基中添加物的作用，在1/2MS培养基中加入椰肉、甘蔗渣、香蕉皮和麦麸等4种添加物，研究不同浓度添加物和培养时间对原球茎生长和多糖含量的影响。结果表明，4种添加物对铁皮石斛原球茎的增殖、分化和多糖含量均有一定影响，其中添加15.0 g·L-1甘蔗渣，培养60 d能明显促进铁皮石斛原球茎的增殖与分化（146.1%）；而添加20.0 g·L-1甘蔗渣，培养40 d能显著提高铁皮石斛原球茎多糖含量（50.4%）。这说明甘蔗渣是培养铁皮石斛原球茎的适宜添加物，既能促进铁皮石斛原球茎的生长发育，还能降低生产成本。徐玲等[25]同样对多种天然有机物进行组合添加，探索具有促进作用的有机附加物新种类和新组合。在原球茎增殖培养基中添加100 g·L-1土豆汁与100 g·L-1其他有机物（香蕉汁、玉米汁、西瓜汁、荔枝汁及小麦面粉），以土豆汁与玉米汁对增殖的促进效果最佳（平均增殖5.66倍，鲜重提高4.12倍），而分化程度较低（分化率67.9%，排第3），适合作为原球茎继代培养前期的添加成分。添加土豆汁与小麦面粉，原球茎分化率（平均95.1%）和鲜重增加（平均5.35倍）最高，分化苗健壮度最高，适合作为原球茎继代培养后期的添加成分。在铁皮石斛幼苗阶段，对天然附加物也有进一步的研究，董燕婧等[26]以铁皮石斛试管小苗为材料，以MS+0.5 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA+20 g·L-1蔗 糖 +6 g·L-1琼脂为基础培养基，采用正交试验设计方法研究3种不同添加物（普通香蕉汁、食用马铃薯汁、活性炭）对铁皮石斛幼芽生长的影响。结果表明，香蕉汁对铁皮石斛的鲜质量、根数、茎高有促进作用，在促进茎的伸长方面效果较为显著；马铃薯汁对铁皮石斛的根长、茎粗影响不大，但在鲜质量和茎高等方面有显著性促进作用；添加一定量的活性炭可以促进铁皮石斛根的生长。在基础培养基里添加30%香蕉汁，10%马铃薯汁，0.6 g·L-1活性炭，有利于铁皮石斛的壮苗生根。

4 培养方式

摇床的转速快慢对原球茎在培养过程中对氧气的吸收有重要的影响，因此同样影响原球茎的生长和多糖的积累。韦晓新等[11]的研究表明当初始培养基的pH值为7.0，接种量选择30 g·L-1时，选取110 r·min-1为原球茎培养最适摇床转速，有利于原球茎的生长和增殖。有研究表明原球茎在培养过程中发生褐变与摇床的转速有关，经过悬浮培养90 d后，原球茎在高转速培养中开始褐变，颜色发黄，而在低转速中未褐变，长势良好[5]。其结果与上述的试验结果不一致，需要进一步研究。培养瓶的材质同样对铁皮石斛原球茎的生长有影响。万珠珠等分别设置N6+玻璃瓶、N6+塑料杯、1/2 N6+玻璃瓶、1/2 N6+塑料杯4组处理进行增殖培养。认为塑料杯的污染率为8%，大于玻璃瓶的污染率3%；N6培养基在玻璃瓶下对铁皮石斛原球茎分化最好[27]。

培养周期对悬浮培养下原球茎的生长代谢有很大的影响，当继代培养的周期过长时，营养物质会逐渐消耗殆尽，原球茎的生长发育就会减缓，与此同时培养基中会积累有害物质，进一步影响原球茎的增值；而周期过短，不利于原球茎对培养基的吸收，浪费实验材料。有研究表明的原球茎培养周期为45 d[22]；而宋经元等[28]经过研究表明，30 d的培养周期可使原球茎的干重与鲜重的比值、增殖系数等指标均达到最佳，而通过缩短培养周期的试验发现，原球茎较以前相比生长周期明显加快。魏小勇[5]的试验证明原球茎的继带周期选择10～15 d比较好，原球茎长势良好而且不易发生褐变。

光照是植物生长发育所必须的，有研究表明原球茎在2 000 Lx光照强度下培养30 d后长势良好，原球茎颜色鲜绿，其多糖的积累量达到了最大[29]。林小苹等[30]以铁皮石斛的原球茎、无根试管苗、茎段和叶片为材料，研究不同光质条件对铁皮石斛原球茎增殖及4种材料中多糖和生物碱含量的影响。结果表明，在绿光下原球茎的增长率明显低于其他光质，在白光和蓝光下原球茎的增长率较好。在4种材料中，蓝光能促进生物碱的合成，有利于生物碱积累，而红光能促进碳水化合物的积累．有利于多糖含量增加，绿光则不同程度地抑制多糖和生物碱的积累。

随着对原球茎规模化培养的研究日益增多，发现接种量与培养基体积对规模化培养有着显著的影响，对工厂化培养有较大的指导意义，也可作为参考依据。宋经元等[28]经过试验研究表明接种量和培养液体积对原球茎生长发育均有影响，接种量对干重与鲜重的影响要大于培养液的体积，而两种因素的互作很小，对两种因素的最佳处理为：接种量6.194 g·瓶-1+培养液体积150 mL·瓶-1或100 mL·瓶-1。

5 研究意义

由于长期过量采集使野生铁皮石斛的资源迅速下降，难以满足日益增长的需求而铁皮石斛的组织快繁存在着许多问题，例如生产成本高、幼苗移栽成活率低等。如今对铁皮石斛原球茎的组织培养研究日益广泛，原球茎可以直接分化成幼苗、成熟植株，而且其可以制作成为人工种子来解决组织快繁中遇到的问题；原球茎中同样含有药用成分，可以直接从中提取以满足需求。利用铁皮石斛原球茎进行组培快繁，建立铁皮石斛高效的组培快繁体系，不仅可保护铁皮石斛野生资源，促进工厂化育苗，还有利于推进铁皮石斛药源的良性发展[31]。

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