单克隆抗体纯化方法比较论述

马 莉 刘 双，2

（1.新疆维吾尔自治区乌鲁木齐县畜牧兽医站，新疆乌鲁木齐 830036；2.新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐 830000）

单克隆抗体制备的理论基础是F. Macfarlane Burnet的克隆选择学说（1959）：每个哺乳动物B淋巴细胞有特异性抗体的潜力。抗体链的恒定区域可能会改变在淋巴细胞克隆的分化过程中，但可变区保留这种奇异的特异性。1975年Kohler和Milstein开发出一种能提高抗原表位的特异性抗体技术；这种技术被命名为杂交瘤技术，用这种方法生产的抗体称为单克隆抗体。随着单克隆抗体的广泛应用，其纯化技术也在快速发展。本文将介绍几种试用于中小规模的抗体纯化方法，通过比较来选择适合的方法。

1 抗体纯化

1.1 沉淀法

沉淀法是利用不同蛋白质疏水性的不同，提高盐浓度，可是蛋白质的疏水性增加，使其沉淀而分离。将30%～50%饱和硫酸铵（AS）加入到血清或者腹水中来沉淀抗体中的免疫球蛋白，通过离心分离沉淀与未沉淀的蛋白质。当重悬沉淀后，获得的上清溶液即为富含抗体的液体。沉淀法的操作非常容易，成本廉价，适用于所有血清和腹水。但同时也存在不足，抗体的提纯效果不高，而且不适用于单克隆细胞培养上清的提纯，有一定的局限性。

1.2 离子交换层析法

离子交换层析法（Ion exchange chromatography，IEC）使用最大的一个限制就是需要知道抗体的等电点（Isoelectric point，pI），很明显，单克隆抗体的pI范围较窄。所用的阴阳离子交换树脂作用于单克隆抗体的效果要好于多克隆抗体。IEC最大的优点是它能分离除去单克隆抗体中的蛋白质A/G、DNA、逆转录病毒及内毒素，所得的单克隆抗体纯度可被认为＞90%，并且适合大多数的抗体及亚型，这对于制备用于动物实验和临床试验的单克隆抗体具备很大价值。但对于其他的抗体纯化效果就变异性很大，纯化范围在60%～95%。

1.3 分子筛层析法

分子筛层析法（Size exclusion chromatography，SEC）是一种较温和的纯化方法，它可用生理条件下的缓冲液将抗体在最适pH中进行纯化。生产所用的树脂主要是在颗粒的孔径度的数值上有所不同。待纯化样品中的大分子不进入胶孔内而先流出，过柱速度快于小分子；小分子流经孔径时被阻止而进入基质，所以后洗脱。生产所使用的柱子均较小，一次只能纯化几毫克的量，但使用SEC仍是增加抗体产品纯度较有效的方法。

1.4 蛋白质A和蛋白质G

蛋白质A和蛋白质G均是细菌细胞壁的一个结构组成，对免疫球蛋白的Fc区域有高度结合亲和性。蛋白质A依据这种特性能够根据亚型来纯化单克隆抗体。例如，小鼠的腹水含有自身免疫球蛋白（一般为IgG1和IgM）和杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体。蛋白质A在低盐条件下不结合IgM，与IgG1有微弱结合，因此，如果单克隆抗体的亚型是IgG2a、IgG2b或IgG3，那么便可获得相对纯净的单克隆抗体。在高盐（3 mol/L）结合缓冲液的条件下，蛋白质A可成功用于纯化IgG1，那么用小鼠为容器所制的单克隆抗体无法清除这些自身免疫球蛋白。

蛋白质A/G是最好的抗体第一步纯化方法，可进行大样本纯化，但经济成本也相对要高得多。考虑到各个实验室实际情况，可将蛋白质A/G凝胶柱重复使用，但要注意若要用于不同抗体的纯化，柱子需再生。

2 结语

抗体的最终用途将决定其被纯化的方法。对于快捷廉价的纯化，沉淀法足矣。但如果用于诊断，蛋白质A/G纯化的抗体能提供好的检测结果的重复性。如果用于临床前期研究，蛋白质A/G纯化的抗体再用IES、SES或疏水作用色谱法进一步纯化将得到高纯度抗体。对于任何临床前期和临床应用，抗体纯化必须在无菌和低内毒素的条件下进行，必须符合当地的法定操作程序。因此对于每个实验室，每种抗体应该确定一种纯化策略，为抗体的生产提供更好更优的条件。