软骨焦磷酸钙沉积与Ca2+/Mg2+失衡的相关性研究进展

谢城 杨春喜

上海交通大学医学院附属仁济医院骨关节外科（上海200001）

焦磷酸钙沉积（calcium pyrophosphate deposition，CPPD）多发生于纤维软骨和透明软骨，也可见于滑膜、椎间盘、韧带或肌腱，是导致老年人发生软骨钙化的常见原因。虽然大部分患有软骨CPPD的患者并没有明显的临床症状（无症状CPPD）[1]，但是长期的CPPD可能会导致关节退化，发展成骨关节炎。当焦磷酸钙（calcium pyrophosphate，CPP）结晶进入关节腔间隙时，会诱发急性CPP晶体关节炎发作，分解软骨细胞和滑膜细胞，产生金属蛋白酶和前列腺素水解细胞外基质[2]。其主要临床表现为患者出现持续数周或者数月的发热、寒战、以及全身中毒症状，体征为患病关节表面皮温升高，出现红斑或者肿胀[3]。由于此病临床表现类似于痛风，临床上又将其称为“假性痛风（pseudogout）”。需要特别说明的是，痛风通常发作的部位位于第一跖骨处，而急性CPP晶体关节炎好发于膝关节、髋关节等处[4]。由于目前CPPD的发生机制尚未研究清楚，临床上对此病主要采取支持和对症治疗，无法从根本上抑制疾病的发展进程。晶体的长期存在将影响软骨的生物力学特性并且破坏关节[5]。近几年来关于低镁血症导致Ca2+/Mg2+失衡，进而导致异位钙化的研究相继报道，应用一定剂量的镁盐能改善CPPD患者的症状[6]，越来越多的证据表明Ca2+/Mg2+平衡可以维持稳态抑制异位钙化。因此探索Ca2+/Mg2+失衡导致CPPD发生的具体机制，是未来研究重点。

1 Ca2+/Mg2+失衡导致CPPD的流行病学研究

自1966年一例甲状旁腺切除术后继发急性CPP晶体滑膜炎伴急性低镁血症的病例被报道后[7]，在特发性低镁血症、Gitman综合症（一种常染色体隐性遗传的肾小管性疾病，由于肾脏排泄镁过多，导致低镁血症）、短肠综合症（由于肠道吸收镁功能障碍导致低镁血症）的病例报告中也都观察到了CPPD与低镁血症共存的现象[8-10]。近年一项关于50314名美国退伍军人的CPPD发病率的调查研究发表，再次证实了低镁血症与CPPD发生相关[11]。即使血清镁处于正常范围内，Mg2+降低也与膝关节软骨CPPD存在一个剂量反应关系[12]。然而，细胞试验表明，在含有不同配比的Ca2+-Mg2+培养基中培养软骨细胞，其细胞基质钙化不仅仅局限于Mg2+浓度降低，当培养基中Mg2+和Ca2+浓度成倍升高时，软骨细胞基质也存在钙化现象[13]。因此，Ca2+/Mg2+失衡是导致CPPD发生的可能原因。

2 Ca2+/Mg2+失衡导致软骨CPPD发生的机制

尽管CPPD发生的机制还没有完全研究清楚，但在软骨细胞外基质易形成CPP晶体是导致疾病发生的第一步[14]。首先，CPP晶体很少在非软骨组织中形成，这说明了软骨基质的特异性。其次，软骨细胞持续释放一种外泌体囊泡，称之为“关节软骨囊泡”，可以作为晶体形成的重要部位[15]。软骨细胞膜上的胞外核苷酸焦磷酸酶（eco-nucleotide pyrophosphatase 1，ENPP1）处于高活动水平[16]，通过水解不断自发释放的腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP），在软骨细胞周围产生高浓度的焦磷酸盐。因此，当体内Ca2+浓度出现异常波动时，软骨基质中更易产生CPPD。

在骨骼系统中，细胞外Ca2+与Mg2+都发挥着重要作用。Ca2+浓度与Mg2+浓度保持相对平衡尤为重要。骨骼系统作为Mg2+储存库，Mg2+的浓度无时无刻不随着机体内的成骨和破骨活动而进行调节。Mg2+作为Ca2+的拮抗剂，当机体出现低镁血症时，细胞内的Ca2+/Mg2+平衡被打破，钙的吸收和沉积将会产生紊乱，细胞内依赖Ca2+的生命活动必定会受到影响。研究表明Ca2+/Mg2+比值是成骨分化、组织矿化和细胞外基质钙沉积的主要调节因子。高浓度的Mg2+可以抑制血管平滑肌细胞外基质的钙化[17]。高浓度Ca2+诱导的软骨钙化可以被高浓度的Mg2+所抑制[18]。血管壁的异位钙化可以通过口服Mg2+补充剂得到缓解，这些研究都表明Mg2+可以抑制组织钙化。当体内Ca2+浓度出现异常波动时，软骨基质中易产生CPPD[19]。而Mg2+可能是通过影响以下多个环节而实现抑制CPPD。

2.1 Ca 2+/Mg 2+失衡与焦磷酸盐代谢

软骨细胞周围的焦磷酸盐主要来源于细胞内ATP在细胞外的分解。这一过程依赖于软骨细胞膜上表达的三种重要的调节焦磷酸盐代谢的膜蛋白，分别是ENPP1、组织非特异性碱性磷酸酶（tissue non-specific alkaline phosphatases，TNAP）和由ANKH（the human homologue of protein product of the murine progressive ankylosis gene）表达的膜蛋白。ENPP1水解流出到细胞外的ATP产生焦磷酸盐，ANKH将细胞内的焦磷酸盐输送到细胞外，TNAP将细胞外的焦磷酸盐水解成磷酸盐。通过ENPP1/TNAP的作用，将磷酸盐/焦磷酸盐维持在一个动态平衡的水平。

流行病学研究表明，ANKH突变与家族性CPPD发生有关，过量表达的膜蛋白使得细胞外焦磷酸盐浓度升高[20]。Cailotto等发现Ca2+内流进入细胞后将激活激酶1和蛋白激酶C，引发级联反应，激活ANKH膜蛋白的启动子，导致其大量合成，通过阻断T型和L型电容Ca2+通道可以有效抑制住上述过程[21]。Mg2+作为Ca2+的拮抗剂，可以有效阻断电容Ca2+通道[22]。低浓度的Mg2+导致Ca2+通道激活曲线向正电位的转移同时增加峰值电流振幅[23]。TNAP有四个金属结合位点，两个为Zn2+结合点，剩余两个分别为Mg2+结合点和Ca2+结合点。Hoylaerts等发现在体内PH为7.4的情况下，Mg2+和Ca2+在激活TNAP时存在一定的互补关系，当Mg2+相对降低时，Ca2+将代偿性升高维持TNAP的正常功能，然而当Ca2+浓度升高时，将导致Zn2+与TNAP结合受到抑制，TNAP失活，从而造成焦磷酸盐的堆积[24]。ENNP1基因敲除的小鼠通过在孕期进行高镁膳食可以有效调节Ca2+/Mg2+比例，抑制全身软组织的异位矿化[25]。

2.2 Ca 2+/Mg 2+失衡与ATP

ATP作为细胞内的能源物质，通过与二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）相互转化实现储能和释能，并随着细胞内的生命活动不断合成分解。在软骨中，大部分的无机焦磷酸盐都来源于细胞外ATP的分解[26]，胞内ATP的流出对无机磷酸盐的浓度至关重要。ATP主要是通过自分泌或旁分泌的方式经缝隙连接半通道流出到细胞外液。

Mg2+与Ca2+影响连接蛋白半通道打开，细胞外的Mg2+浓度升高将导致离子通道的最大传导速度降低，减慢通道的激活。Mg2+进入孔道，以压敏电阻器的形式阻断通道，使通道处于阻断状态，不易打开[27]。而低浓度的Ca2+和Mg2+将导致通道开放增多，大量ATP释放[28]。

2.3 Ca 2+/Mg 2+失衡与嘌呤受体

进入到胞液中的ATP将激动嘌呤受体（purinergic receptor，PR），通过激活β型磷脂酶C，生成三磷酸肌醇，引发钙振荡（即Ca2+浓度的升高在单个细胞水平是以振荡的形式出现的）。细胞内钙信号主要是以钙振荡的形式产生。PR是一种广泛分布于真核细胞膜上的膜受体，根据其配体不同，分为P1（腺苷）受体和P2（ATP）受体。在人体内P2受体又主要分为两种类型，一种是P2X受体（配体门控阳离子通道），另一种是P2Y受体（G蛋白耦联通道）[29]。

Orriss等[30]发现ATP通过与成骨细胞膜上的P2Y2受体结合，增强ENPP1的作用，最终导致细胞外液焦磷酸盐的升高。Masser等[31]发现肝细胞释放ATP可以引起邻近细胞内Ca2+的升高，当用ATP磷酸二酯酶降解细胞外的ATP或者应用苏拉明降解阻断嘌呤受体时，Ca2+浓度升高受到抑制。Mg2+作为广受认可的剂量依赖型的嘌呤受体拮抗剂[32]可以阻止ATP与嘌呤受体的结合，减少钙振荡的发生，使胞浆内Ca2+维持在稳定的水平。Yang等[33]发现含有高浓度Mg2+的培养基中细胞上清液的ATP含量低。而Yue等[34]通过研究发现高浓度的Mg2+可以抑制嘌呤受体P2X4、P2X5和P2X7的表达，而高浓度的ATP（＞100 mM）能够逆转Mg2+的抑制作用。

2.4 Ca 2+/Mg 2+失衡与线粒体

线粒体和内质网作为细胞内Ca2+的储存库，维持细胞内Ca2+的平衡。发生于基质小泡和软骨细胞线粒体内的矿化，开始于线粒体内钙磷沉积形成的线粒体颗粒。近年来研究发现胞浆内的Mg2+可以减弱线粒体对Ca2+的吸收。Szanda等[35]通过将HEK293T细胞中的线粒体分离出来，清楚地观察到了Mg2+抑制Ca2+的吸收现象。但其中的具体机制还在探索当中。

目前有一种假设认为与线粒体膜通透性转换孔（mitochondrial permeability transiti-on pore，mPTP）有关。当质子和离子通过mPTP进入线粒体时，将导致线粒体内膜去极化，从而影响ATP的释放[36]。Yue等[34]通过使用共聚焦显微镜观察不同镁浓度培养下的肌腱间充质干细胞发现，高浓度的Mg2+通过与Ca2+竞争mPTP的结合位点可以抑制线粒体内的钙浓度以及抑制Ca2+诱发mPTP的开启。这项研究的结果与Panov等[37]对Mg2+与小鼠肺细胞线粒体的关系研究中得到的结果一致。当Ca2+浓度增加时，导致mPTP打开，大量涌出的Ca2+被H+代偿，消耗的H+浓度由ATP水解来代偿，从而导致细胞基质中Mg2+和ADP的增加[38]。而当胞浆内低浓度Mg2+时，将导致胞浆内Ca2+浓度升高，大量Ca2+释放到软骨细胞周围的基质中，与焦磷酸盐形成CPPD沉积。未来对mPTP进一步研究有利于理解钙、镁之间的平衡关系。

3 治疗方法

对于临床上的急性CPP晶体关节炎发作，目前主要是采用非甾体类抗炎药或者糖皮质激素来缓解症状。由于非甾体抗炎药导致胃肠道出血这一不良反应以及老年人的多种疾病共存，使这些药物应用受到了限制。近几年来，关于甲氨蝶呤、生物类药物以及促肾上腺皮质激素应用于CPP晶体关节炎的治疗研究陆续发表，但由于所做研究样本量太小或者不属于随机对照实验等原因，导致证据强度不够。欧洲风湿病协会目前还没有推荐任何药物来预防CPP晶体的产生，然而体外试验显示高浓度Mg2+可以溶解CPP晶体。Hruby等[39]通过对美国心肺血液研究所的弗明汉心脏研究数据进行二次分析发现，摄入的镁含量与冠状动脉钙化呈现高度的负相关性，至于未来是否推荐使用含镁药物进行临床预防软骨CPPD，将需要大样本的随机对照试验来提供循证证据。

4 展望

软骨CPPD的发病机制目前尚不明确。基于临床活检通常只能在软骨CPPD发生后进行，尚无适当的手段监测体内动态钙化发生过程。关于CPPD的研究目前多集中于细胞分子生物试验，未来尚需进行动物试验进一步探索Ca2+/Mg2+失衡导致软骨CPPD的机制。研究清楚正常的Ca2+/Mg2+平衡如何抑制软骨CPPD的分子生物学机制，将为临床上治疗CPPD带来新的思路，从根本上抑制软骨CPPD的发生和进展。