聚合酶链反应检测真菌感染的检验学研究

柳大芳 李 青 刘晓华

（1 辽宁省辽阳市中心医院检验科，辽宁 辽阳 111000；2 辽宁省辽阳市疾病预防控制中心微生物检验科，辽宁 辽阳 111000）

近年来，临床真菌感染的发病率和严重性明显增加，从病灶中分离的真菌种类也愈来愈多。常规形态学和培养方法已不能满足临床需要，本研究应用聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术，以NSS-NS6为引物，扩增真菌同源性序列ssu-rDNA片段，通过检测临床主要致病真菌，探讨PCR检测真菌的具体实验条件，试图建立一种快速检测真菌的PCR检测方法。虽然用PCR方法检测真菌单一菌种的研究不少，但检测广范围真菌国内尚未见报道[1]。

1 资料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 试剂PCR扩增所用引物：5'AACTTAAAGGAATTGACGGAAG和5'GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC（赛百盛北京生物工程公司）。其他试剂均购自多元合众科技发展有限公司。

1.1.2 标本。真菌：白色假丝酵母菌ID00147，新型隐球菌ID00044，热带假丝酵母菌ID00162，烟曲霉ID00203，购自中国医学科学院南京皮肤病研究所真菌收藏中心；热带假丝酵母菌AS402，高大毛霉菌AS2232，黑根霉菌AS2257，购自中国科学院微生物研究所。所有菌种均保存于沙保氏琼脂斜面培养基上。人体细胞：正常人新鲜全血2份，来自张家口市中心血站健康献血员，用于人体细胞DNA扩增。细菌：大肠埃希氏菌CMCC44105，金黄色葡萄球菌ATCC8095，铜绿假单胞菌ATCC27313，甲型溶血性链球菌CMCC32213，乙型溶血性链球菌CMCC32204，肺炎链球菌CMCC31401，购自卫生部生物制品检定所；耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和耐甲氧西林表皮葡萄球菌（MRSE)，协和医院微生物科赠送。

1.2 方法

1.2.1 真菌DNA的提取：①将真菌于50 mL沙保氏液体培养基中25 ℃培养40 h，3000 r/nlin离心10 min，0.9%氯化钠溶液洗涤2次，沉淀-20 ℃冰冻4～6 h。②将冰冻菌与石英砂共同研磨至呈黏稠状（边研磨边加入少量含50 mmol/L Tris-Cl pH7.2，50 mmol/L EDTA，3% SDS，1%2-琉基乙醇的溶液），3000 r/min离心10 min，去除石英砂，上清液65 ℃温育1 h。③加入等体积酚：异戊醇：氯仿（25∶24 ∶1）溶液，10000 r/min离心15 min，至上清水相变清。④移出上层水相（注意勿带人界面的细胞碎片），加入1/10体积3 mol/L乙酸钠、2体积95%乙醇，混匀，4 ℃冰箱放置至少1 h，10000 r/min离心15 min，弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀3次。⑤将离心管倒置，在无菌罩中干燥。⑥加入适量TE缓冲液（含10mmol/L Tris-Cl，1 mmol/L EDTA）溶解沉淀，l μL溶液用于PCR扩增。

1.2.2 PCR扩增。①PCR扩增体系：总反应体积为100 μL，其中：10×扩增缓冲液10 μL；4×dNTP（每种浓度均为1 mmol/L）20 μL，终浓度为20 μmol/L；引物1和引物2（浓度20 μmol/L）各l00 pmo1；TaqDNA聚合酶0.5 μL（2.5 U）。②PCR扩增反应程序参照预变性：94 ℃，5 min。三温循环：94 ℃变性1 min；58 ℃退火2 min；72 ℃延伸3 min。30个循环。末延伸：72 ℃10 min。约需3 h。③PCR扩增产物的分析：采用琼脂糖凝胶电泳法对扩增产物进行分析。琼脂糖凝胶浓度为1.5%，内含0.5 μg/mL溴化乙锭（EB)，使用0.5×TBE电泳缓冲液。取10 μL扩增产物点样，电压为3.5 V/cm，电泳时间为40～60 min。PCR Marker作参照物，在紫外灯下观察并拍照。

1.2.3 特异度及重复性实验：对细菌、人体细胞扩增，以白色假丝酵母菌为阳性对照进行特异度实验，方法用1.2.2并在不同日期重复3次。

1.2.4 灵敏度实验：白色假丝酵母菌DNA用紫外分光光度计测其含量（10D约为50 μg/mL双链DNA)，10倍稀释为1ng～10 fg，按1.2.2的方法进行灵敏度实验。

2 结 果

2.1 真菌DNA扩增结果：若样本含有与引物相应的基因片段，扩增后的产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下可见发淡黄绿色荧光的清晰条带，即为阳性结果。本实验中所有真菌均扩增出相同长度的DNA片段。对照PCR Marker，该基因片段约为310bp。表明该实验所用引物系统是真菌所共有的，这与前人报道相符。

2.2 特异度及重复性实验：以白色假丝酵母菌DNA为阳性对照进行扩增，8株细菌和2株人体细胞均未扩增出相应的产物。重复性实验结果相同。

2.3 灵敏度实验：以样品中含有1ng～10 fg（10倍稀释）纯化的白色假丝醇母菌DNA进行灵敏度实验，当含有1Pg DNA时，用该方法即可检出。

3 讨 论

患者发生感染时，临床首要解决的问题是确定感染源的类型，虽然不同真菌感染其治疗方案不尽相同，但两性霉素B是常规治疗药物。由于两性霉素B的毒性作用，临床医师在确诊之前很少用此药。但是，如能迅速确定真菌感染，尽早应用两性霉素B会产生很好的疗效。显然，真菌感染的快速诊断具有重要临床意义[2-3]。

PCR检测真菌的特异度是由其应用的引物及其检测的靶基因片段的特异度决定的。用于PCR真菌检测的靶基因主要有以下几类：①编码细胞色素P450L 1A1的基因，其编码唑类抗真菌药物作用位点麦角固醇生物合成过程中的一种酶；或编码真菌特异度保守蛋白如肌动蛋白的基因。其缺点是作为一个单倍体单拷贝基因，缺乏选择性，且敏感度差。②白色假丝酵母菌特异度序列，如热休克蛋白90基因等，只能扩增酵母菌而不能扩增其他真菌。③以多拷贝形式存在的rDNA序列，目前其检测应用极受重视，原因有二：①其敏感度高于单拷贝靶基因的检测。②有可供真菌不同水平检测的靶基因序列。本研究就是用PCR方法，通过对真菌同源性序列ssu-rDAN片段扩增，以期建立真菌感染的检测方法。目前，检测真菌所用的引物很多，其中报道较多的是引物NS5-NS6。Hopfer和Polanco均以该引物扩增临床主要致病真菌获得成功。本研究以NS5-NS6为引物对临床6种主要致病真菌以及8种细菌和2株人体细胞进行扩增，真菌全部扩增出一个约310bp的片段，而细胞和人体细胞均扩增阴性，也证明该引物的扩增产物是真菌界所特有的DNA片段，可用于广范围真菌的鉴定。以琼脂糖凝胶电泳法分析扩增产物，当样品含有1pgNDA时即可检出，这亦与前人报道基本一致[4]。

当然，该研究只是一个初步研究，还存在不少问题，如检测真菌菌株较少，真菌破壁方法的改进等，需今后进一步研讨。

总之，以上研究结果表明用PCR扩增真菌同源性ssu-rDNA具有高度的特异度和敏感度，而且缩短了检出时间。若深入研究，有可能成为诊断真菌感染的一种实用、理想的方法。