卵黄抗体的结构与功能其在人及动物疾病中应用进展

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卵黄抗体(Immunoglobulin of egg yolk/egg yolk antibody, IgY)是指特定抗原刺激禽类B淋巴细胞，由B细胞分化成浆细胞并由此分泌特异性抗体进入血液循环，当血液流经卵巢时在卵细胞中逐渐蓄积，形成卵黄抗体。卵黄抗体具有性质稳定、特异性强、制备成本低、口服安全等优点在家禽、家畜传染病的防治中已得到广泛的应用。产品的开发也在生态农业和食品安全方面产生了良好的经济效益和社会效益。在诊断、预防和治疗人类和动物各种疾病中具有良好的应用价值。IgY的产品在动物疾病防治应用报道较多，在医学中产品研发与应用报道较少，本文就IgY产品研发及应用进行综述。

1 卵黄抗体结构功能及研发进展

1.1IgY的分泌 禽类的免疫系统包括细胞和体液免疫系统，分别受法氏囊和胸腺的控制。当机体受到外来抗原刺激后，体内主要发生体液免疫，法氏囊内的B细胞活化、分化成为浆细胞，浆细胞分泌针对抗原的特异性抗体进入血液循环，特异性抗体(主要是IgG)随着血液流经卵巢，并在卵细胞中逐渐蓄积，形成卵黄抗体。流经输卵管的血液中的特异性抗体(主要是IgM)和IgA进入卵清中，形成卵清抗体。与卵黄抗体相比，卵细胞在输卵管中移行的时间较短，因而卵清抗体含量极微。

1.2IgY的结构 IgY分子结构与哺乳动物的IgG相似。lgY是一种7S免疫球蛋白,总分子量约180 kD,由两条轻链和两重轻链组成，分子量分别是22-30 kD、67-70 kD。IgY具有典型的免疫球蛋白的空间构象,也可与抗原结合,但其重链上的氨基酸组成与lgG相差很大[1]。IgY的重链由4个恒定区(Cv1-Cv4)和1个可变区组成,没有铰链区, Cv 2、Cv 3之间存在两个重链间二硫键。而哺乳动物IgG只有3个恒定区(Cγ1-Cγ3)。最近的研究表明：IgY的疏水基团多于IgG,这恰好使它更适于脂类含量丰富的卵黄环境。比较IgY和IgG的恒定区发现,IgY的Cv 3、Cv 4区与IgG的Cv 2、Cv 3区十分相似,而Cv 2区可能经“压缩”形成IgG的铰链结构。相对于重链而言,两者轻链结构上差异较小,氨基酸组成的相似性较大。IgY由于结构中比IgG重链多了一个恒定区,但却没有IgG特有的铰链区,所以IgY的分子量较大,摆动性、柔韧性下降,稳定性较高[2]。

1.3IgY的功能优势 卵黄抗体与一般哺乳动物来源的抗体相比，具有以下优势：①经济易得：实验动物来源广泛，制备提取纯化过程简单，制备等量的抗体动物成本更低，产量高；②性质稳定：较强的耐酸、耐热、耐高渗性能和一定的抗酶降解能力。当pH为3.5 ～11.0时，IgY 活性比较稳定，高于或低于这个范围时IgY 活性会迅速下降。当温度低于75 ℃条件下，IgY具有良好的热稳定性。在室温存放6个月或在4 ℃条件下存放5年对其活性无明显影响。IgY对胃蛋白酶也有较好的耐受能力，但对胰蛋白酶十分敏感，IgY分别与胰凝乳酶和胰蛋白酶温育8 h，仍能保持一定的活性[3]；③减少假阳性和假阴性：IgY 不与血清中的类风湿因子、人抗鼠抗体、抗-IgG抗体和抗体结合物发生交叉反应，不激活补体系统等，也不与葡萄球菌蛋白A(SPA) 和链状球菌蛋白G 发生反应，可以明显减少假阳性或假阴性的产生，增强检测特异性[4]；④与血清不产生交叉反应：由于禽类和哺乳动物之间存在明显的种系和基因学背景差异，IgY 能识别更多的哺乳动物抗原表位，从而增强免疫信号，提高了IgY灵敏度；⑤特殊抗体形成率高[5]；⑥有诊断、预防、治疗的作用：可以做为食品或者食品添加剂以口服的方式达到防治疾病的作用，也可以做为诊断试剂检测疾病。因此，IgY具有的检测特异性强、灵敏度高、性质稳定、安全等优点使其广泛地应用于食品、农业和人及动物疾病中。

1.4国内外已开发的IgY专利 从1893年Klemperer发现IgY，国外关于IgY的研究和应用较多。根据初步资料显示IgY早期专利也集中在动物应用产品方面。国外由最开始禽病防治，到兽类、养殖类甚至人类疾病、食品工业及农业等各方面均有涉及。国外早期将IgY作为饲料添加剂用于动物生长繁殖及各种疾病的预防防治，后来研发出制成口服液、喷雾剂或作为食品添加剂等用于抗炎、抗感染、抗肥胖、抗胃肠道疾病等各个方面和领域的IgY，并申请相关专利[6-9]。国内IgY研发起步比较晚，近年来快速增长，国内很多生物技术公司也开始类似产品研发。如重庆和润实业有限公司申请了制备抗禽类病毒性、细菌性疫病、抗仔猪黄痢、白痢病原菌、抗奶牛乳腺炎病原菌复合卵黄抗体的专利并应用于治疗相关疾病药物或饲料添加剂中。中国在抗寄生虫、细菌、病毒或其他方面关于卵黄抗体的专利有300多篇，随着科技的发展和进步会有更多的产品研发并投入实际应用中。

2 卵黄抗体在人及动物疾病诊断的应用

禽类与哺乳系动物种系关系较远，卵黄抗体与人和哺乳动物免疫球蛋白有许多不同之处，IgY不与金色葡萄球菌A蛋白结合、哺乳动物Fc受体结合，对哺乳动物补体无固定作用等，这使得卵黄抗体在检测诊断上具有更强的特异性和灵敏度，能避免试验假阳性。IgY制备简单、产量高，有望取代传统的多克隆抗体的生产，获取大量更有效的抗体。IgY可以应用于免疫荧光试验、ELISA试验、免疫扩散、免疫电泳等。

2.1IgY在病毒感染诊断中的应用 赵文思等用纯化的HIV-1P15蛋白免疫产蛋鸡制备鸡卵黄抗体，通过优化组合获得了高纯度的IgY，纯化的抗体能够与HIV-1病毒蛋白P15特异性结合，为HIV感染患者的诊断提供了新思路[10]。严重急性呼吸综合征冠状病毒的核衣壳蛋白(SARS-CoV-NP)可用于判断个体是否感染SARS，A. Palaniyappan等用SARS-CoV-NP免疫产蛋鸡制备抗SARS-CoV-NP的多克隆抗体IgY，SARS-CoV-NP作为包被抗原，单克隆抗SARS-CoV-NP抗体作为捕获抗体，IgY作为检测抗体，采用ELISA双抗体夹心法用于SARS疑似个体的早期诊断[11]。张小莺等[12]用三种灭活的天花病毒(痘苗病毒，calpox病毒和牛痘病毒)免疫三组蛋鸡，制备抗vaccinia virus IgY和抗calpox virus IgY，在高度稀释的情况下，仍可在免疫荧光实验中呈阳性反应，并且特异性卵黄抗体能够与磁珠结合用于天花病毒的PCR检测，研究表明抗痘病毒IgY有望成为一个痘病毒的检测手段。狂犬病是一种由狂犬病病毒所致的人兽共患病，IgY可用于狂犬病病毒感染的诊断，用直接荧光抗体检测方法检测狂犬病毒抗原已经在世界范围内得到广泛应用。IgY作为替代抗体用于检测冰冻肝脏中的甲型肝炎病毒[13]。猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)是断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)等相关疾病的主要病原体，建立猪圆环病毒2型捕获ELISA抗体检测方法检测猪圆环病毒2型[14]。乙型脑炎是由日本乙型脑炎病毒引起的急性人兽共患传染病，黄少梅[15]研制猪乙型脑炎病毒ELISA抗体检测试剂盒。

2.2IgY在细菌和寄生虫感染诊断中的应用 产志贺毒素大肠杆菌能引起一系列疾病，包括腹泻、出血性结肠炎和危及生命的溶血性尿毒综合症(HUS)等，将志贺毒素(STX)作为抗原，制备anti-stx2b IgY抗体，采用双抗体夹心ELISA用于常规快速诊断产志贺毒素大肠杆菌检测的方法[16]。钩端螺旋体病是由钩端螺旋体属的致病性钩端螺旋体引起的传染病，抗钩端螺旋体的单克隆抗体、生物素标记的抗钩端螺旋体IgY抗体采用双抗体夹心ELISA检测待测血清(疑似含钩端螺旋体)[17]。弓形虫表面抗原(SAG1)可作为弓形虫的检测指标，制备出抗SAG1特异性IgY抗体，可用于弓形虫的检测[18]。IgY也为血吸虫病的检测也提供了一种便捷、无创伤的新方法[3]。

2.3在肿瘤标志物检测中的应用 人乳头瘤病毒( HPV) 16 是高危型HPV，与宫颈癌及宫颈上皮内高度病变有着密切的关系，对人乳头瘤病毒(HPV)的基础和临床诊断研究有重要意义。杨军等[19]用人乳头瘤病毒16L1蛋白(HPV16L1)免疫蛋鸡，制备出纯度高、特异强的抗HPV16L1 IgY 抗体，用于检测HPV16L1。乳腺癌的诊断中最常用的是肿瘤抗原15-3(CA15-3)，制备抗 CA15-3 IgY，建立双抗体夹心法ELISA 检测CA15-3[20]。HER2 和端粒酶是乳腺癌诊断的标志因子，Y Xiao等[21]制备抗人HER2和端粒酶单克隆抗体和IgY,采用一种新的量子成像系统，对特定的细胞和组织进行追踪，与哺乳动物的IgG对比，前者表现出更高的亲和性。Y Xiao等制备抗HER2 IgY结合纳米技术可用于HER2的检测和肿瘤的靶向治疗[22]。前列腺特异性抗原(PSA)是一种重要的血清前列腺癌检测、监测和分期的标记物，Agnieszkaupicka-Sowik等[23]用单克隆抗体夹心/IgY /PSA检测ELISA试剂盒，研究结果表明其可能是一个替代哺乳动物抗体诊断前列腺癌的方法。卵黄抗体还可用于卵巢癌和非霍奇金淋巴瘤患者的检测[24]。

2.4其他应用 P Jintaridth等[25]采用卵黄抗体技术是用来产生抗α血红蛋白IgY抗体从而建立酶联免疫吸附试验诊断地中海贫血。转铁蛋白是血清中结合并转运铁的β球蛋白，血清转铁蛋白的含量变化可反映多种疾病，以鸡卵黄抗体IgY 代替哺乳动物抗体IgG 用于表面等离子体共振技术对人血清中转铁蛋白的实时检测[26]。

3 卵黄抗体在人及动物疾病防治中的应用

3.1在病毒性疾病治疗预防方面的应用 轮状病毒(RV)引起的人畜腹泻在全世界范围内是一个重要的公共卫生问题。且特异性IgY口服给药已报道有利于抗轮状病毒感染，实验结果显示口服抗RV IgY降低小鼠RV发病率，表明其在防治轮状病毒相关疾病存在潜在意义[27]。HM Thu等[28]研究口服抗轮状病毒IgY是治疗新生儿轮状病毒腹泻一种安全有效的方法。甲型流感病毒感染人的呼吸系统，可引起急性和致命的肺部疾病，耐药病毒株的出现凸显替代治疗方法的需要，研究显示高滴度抗甲型H1N1流感病毒IgY抗体能特异性结合甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶和血凝素，采用的模型小鼠肺组织保持正常。此外，相比神经氨酸酶抑制剂奥司他韦，该抗体还具有保护活性，因此IgY可以提供一个有效控制流感的替代方法[29]。IgY不仅应用于艾滋病病毒(HIV)的诊断，在治疗上也有一定的应用，Sri Agus Sudjarwo等[30]通过模型小鼠研究口服抗HIV IgY对小鼠急性毒性的影响，总体结果表明口服抗HIV IgY对小鼠不会产生任何明显的毒性作用，因此，抗HIV抗体可用于对艾滋病患者的辅助免疫治疗。诺如病毒(NoVs)是影响全球数百万患者患流行性急性胃肠炎的主要原因，目前，还没有针对此病毒有效的疫苗或抗病毒药物，Ying-Chun Dai等[31]研究中表示特异性抗NoVs IgY可用于可诺如病毒的诊断和治疗。

3.2在寄生虫、细菌性疾病治疗预防方面的应用 隐孢子虫可引起免疫功能低下的人和新生动物腹泻，P23是一种属于23蛋白家族的糖蛋白并表达于寄生虫不同的生活阶段，Zahra Omidian等[32]将小隐孢子虫重组P23应用于本研究中，制备的抗重组P23特异性IgY对隐孢子虫病有抑制作用，可以作为预防动物和免疫功能低下的人感染隐孢子虫的被动疫苗。幽门螺旋杆菌(Hp)感染是胃十二指肠疾病包括急性胃、十二指肠溃疡、慢性胃炎、慢性萎缩性胃炎的主要病原菌，Baoning Wang等[33]研究表明抗HP IgY对Hp生长、HP尿素酶活性具有抑制作用，口服抗HP IgY治疗感染幽门螺杆菌模型小鼠，治愈率可达到83.3%，该抗体有望成为治疗Hp感染有针对性的新药物和治疗方法。Yun-Hui Yang等[34]组合IgY和兰索拉唑或者传统药物联合给药治疗HP，其显示了一定的优越性，此外IgY 克服了抗生素的耐药性，IgY可能是代替抗生素治疗HP引起的胃溃疡的新选择。牙龈卟啉单胞菌(GP)是引起牙周炎重要的原因之一，通过抑制GP而降低其致病性。Kyosuke Yokoyama等[35]研究抗牙龈卟啉单胞菌卵黄抗体(IgY-GP)、龈下刮治术、根面平整术(SRP)治疗方法与龈下刮治术、根面平整术(SRP)治疗方法的比较，证明IgY-GP对牙周炎患者菌群里的GP生长有抑制作用，临床上使用含IgY-GP软膏治疗牙周炎进一步证明此结论，IgY-GP可作为一种有效的免疫治疗牙周炎的药物。IgY在艰难梭菌相关性腹泻的诊断和治疗也有应用。IgY口服已经证明是成功的用于各种消化道感染的治疗，如鲁氏耶尔森菌、产肠毒素大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、迟钝爱德华菌等[36]。

3.3在肿瘤治疗预防方面的应用 特异性IgY在肿瘤患者的应用还处于初步研究阶段，但为肿瘤的治疗和预防提供了一种新的思维。早期李庆昌等[37]从人胃低分化粘液腺癌细胞MGC-803中分离出一种癌蛋白P110，并用其免疫蛋鸡，制备的抗体lgY再与蓖麻毒蛋白的A链偶联成lgY-RicioA免疫毒(生物导弹)，结果表明生物导弹lgY-RicinA治疗上消化道肿瘤有一定的作用。而且刘连瑞等研究显示IgY-ricinA能够选择性的杀伤MGC-803肿瘤细胞且IgY只具有特异识别细胞、而无诱导细胞凋亡的作用，应用于消化系统肿瘤的靶向治疗有一定的潜能。脑胶质瘤是最常见并且多发的中枢神经系统恶性肿瘤。胶质瘤 IgY 抗体能特异、选择性的识别脑胶质瘤组织，因此它可以作为一种小型而高效的导向载体，把毒素有定向地运输到肿瘤细胞上，当载体识别肿瘤细胞后，立即与肿瘤细胞结合而释放毒素，从而达到杀死肿瘤细胞而不影响其它正常细胞的目的。通过对人脑胶质瘤细胞系 U251 IgY 抗体的基本特性分析、鉴定等研究，为脑肿瘤的诊治提供新的思路[38]。

3.4在其他方面的应用 乳糜泻(CD)是一种由麸质引起的小肠自身免疫性疾病，口服卵黄抗角蛋白抗体(AGY)是一种新中和麸质的治疗CD的方法[39]。肿瘤坏死因子1(TNFR1)能调节细胞凋亡，制备的抗TNFR1 IgY纯化后具有较高的特异性，可对某些生物靶标起到快速、直接的保护作用[40]。IgY还可应用于治疗肥胖症，抗脂肪酶IgY可抑制胰脂肪酶活性增加甘油三酯排泄量，达到抗肥胖的作用[41]。此外，IgY在抗蛇毒[42]和抗蝎子毒素[43]、抗生育制品方面都有应用。

IgY研究虽然早，应用广泛，全球专利申请多，但仍存在很多亟待解决的问题，目前卵黄抗体在制备、提纯和使用过程中没有统一的质量标准，在实际应用过程中对卵黄抗体的使用也常停留在利用粗制品对相应病原进行防治，且IgY主要成熟产品是针对动物疾病的，针对人类疾病基本处于制剂研发、专利申报，而成熟产品不多。近年来IgY研发在肿瘤方面也有涉及，但在临床应用上还存在一系列问题，如有效性、安全性以及机理研究都比较薄弱。这些均严重阻碍卵黄抗体的开发和利用，因此在如何提高抗体的防治效果、降低生产成本以及代替普通抗体发挥作用的问题有必要进一步探讨和研究。由于IgY 具有性质稳定、低交叉反应性、无耐药性、特异性高、可口服等优点，随着对IgY机理深入研究和相关技术的发展，在诊断试剂开发、人及动物疾病防治、肿瘤靶向治疗以及与食品安全的针对动物疾病的产品研发应用等方面有望取得新进展。

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