臭氧在中晚期原发性肝癌的应用探索

张洁，付海艳，罗煜

昆明市第三人民医院姑息治疗科，云南昆明 650041

臭氧(Ozone)也称三氧，是氧气的同素异形体，由三个氧原子组成，是一种强氧化剂，常温下半衰期约20 min，易分解，易溶于水。臭氧属于有害气体，浓度为0.3 mg/L时，对眼、鼻、喉有刺激的感觉，浓度3～30 mg/L时，出现头疼及呼吸器官局部麻痹症状，浓度15～60 mg/L时，对人体有害。自1958年浓度剂量可调控的臭氧发生器诞生后，臭氧在医学领域得到了广泛的应用。在适当剂量（0.3～0.5 ppm）下，臭氧对癌细胞起剂量依赖性的生长抑制作用，且在适当剂量范围内对人体正常细胞无明显损害。臭氧可诱导肿瘤坏死，抑制肿瘤细胞增殖。在缺氧环境下，缺氧诱导因子1A（HIF1A）可调节基因转录介导机体适应性反应。低氧环境下胞核HIF-1A表达明显增高，臭氧治疗可抑制HIF-1A水平，从而在慢性损伤等疾病中发挥治疗作用。

1 肝癌的流行病学现状

根据2012年全球癌症统计数据[1]，肝癌居全球癌症死亡原因第三位，发病数居第五位，而在发展中国家，其发病数及死亡数均居男性癌症患者第二位。仅2012年，全球有大约78万新增肝癌患者，约74万因肝癌致死，其中，新发及死亡病例中，中国均占了50%左右。根据云南省疾病控制中心的调查[2]，肝癌高居云南省恶性肿瘤死亡病例第二位。我国原发性肝癌患者多数有病毒性肝炎（多为乙型肝炎）背景，因此，其肝功能储备较差，相当部分患者无法进行手术治疗，且原发性肝癌70%～90%病理类型为肝细胞癌，对放化疗均不敏感。因此，在中晚期原发性肝癌患者中，如何在肝功能保护的同时寻找合适的治疗方法以缓解患者症状、提高生活质量仍是值得临床关注的问题。

2 臭氧抗炎、抗病毒的研究

臭氧在病毒性肝炎、肝硬化及急性肝损伤的临床及实验研究表明，臭氧对肝功能有一定的改善作用。Zaky等[3]应用臭氧自体血回输/微量自体血回输/直肠注气联合治疗慢性丙肝患者，研究共纳入52名慢性丙肝患者，其中40名患者采用臭氧联合疗法，12名患者采用传统治疗（水飞蓟素及复合维生素）。结果显示ALT/AST正常率及HCV RNA转阴率均显著高于对照治疗组。郭亚兵等[4]回顾了2005-2014年应用臭氧治疗肝炎的临床研究，结果显示从慢性乙（丙）型肝炎、肝硬化和肝衰竭不同肝病类型及阶段，臭氧疗法均显示出抗病毒、抗炎护肝及改善症状的效果，且治疗耐受性良好。Zaky的研究团队[5]纳入15名肝硬化患者，给予臭氧（300 mL浓度为40%臭氧/纯氧混合气体，疗程为12次）直肠注气治疗，治疗前及末次治疗后半小时分别在超声指引下取门静脉血，测量门静脉氧分压及饱和度，结果显示臭氧直肠注气治疗可显著提高门静脉氧合水平。这一结果可能在一定程度上解释了臭氧直肠注气治疗对肝功能改善的机制。

3 缺氧诱导肿瘤细胞的增殖

氧稳态是肿瘤进化、发展的生理基础[6]。缺氧在肿瘤发展及转移中的作用日益得到重视。臭氧可以为肿瘤内提供充足的氧分压，在癌症发生部位提供足够的氧抑制肿瘤生成及恶性度增加，达到细胞水平上抑制癌细胞的生长。在缺氧环境下，缺氧诱导因子1A（Hypoxia-inducible factor 1A,HIF1A）可调节基因转录介导机体适应性反应。HIF1A已被证实是促红细胞生成素（调节红细胞生成）、血管内皮生长因子（VEGF，促血管生成）及糖酵解酶等多种基因的调节因子，从而调节肿瘤缺氧微环境的适应性细胞代谢[7]。既往已有多个研究[8-9]显示臭氧治疗可抑制HIF-1A水平，从而在糖尿病肾病、软组织损伤等疾病中发挥治疗作用。来自西班牙的Clavo团队[10]纳入18例晚期恶性肿瘤患者，应用臭氧自体血回输进行治疗，测定肿瘤氧合情况。结果显示，臭氧治疗后患者低氧指数（PO2≤10 mmHg或5 mmHg比例）明显降低，且氧合增加与肿瘤初始PO2值呈明显非线性负相关，提示缺氧越严重的肿瘤，臭氧治疗获益越明显。Bowyer等人[11]在常氧及低氧环境下将HepG2细胞与阿霉素/雷帕霉素/二者联合应用分别培养，结果显示低氧环境下HepG2细胞对药物抵抗力明显增强。Western-blot结果显示低氧环境下胞核HIF-1A表达明显增高，有效剂量的阿霉素/雷帕霉素均可显著抑制胞核HIF-1A表达，提示低氧在肝癌发展及化疗抵抗起重要作用，针对低氧及HIF-1A的治疗可能是肝癌治疗的重要方向。低氧环境可促进肿瘤细胞的生长。臭氧清除肿瘤放化疗过程中形成的自由基，消灭残留的肿瘤细胞，增加局部氧饱和度，增强肿瘤对放化疗的敏感性。

4 臭氧对癌细胞的抑制

早在1980年，来自美国华盛顿大学的Sweet等人[12]在science杂志上发表的研究显示将臭氧与人肺泡腺癌细胞、乳腺癌细胞、子宫肉瘤细胞及子宫内膜癌细胞共培养，在适当剂量（0.3-0.5ppm）下，臭氧对癌细胞起剂量依赖性的生长抑制作用，且该剂量范围内，臭氧对对照细胞（二倍体成纤维细胞）无抑制作用。增加剂量至0.8 ppm，癌细胞生长抑制超过90%，而对照组细胞抑制仍不到50%。表明臭氧对人类癌细胞可有剂量依赖生长抑制作用，且在适当剂量范围内对人体正常细胞无明显损害。Schulz等人[13]的研究制作VX2头颈部鳞状细胞癌新西兰兔动物模型，分别予臭氧/纯氧混合气体，纯氧及对照治疗，结果显示臭氧/纯氧混合气体腹腔注气组14只实验兔存活7只，其中6只肿瘤完全消失且未见局部及远处肺转移。纯氧治疗组13只实验兔存活3只，2只肿瘤完全消失。对照组14只实验兔仅1只存活。且研究发现臭氧/纯氧混合气体治疗组中肿瘤消失的实验兔对VX2再植入可产生抗性。Kuroda的研究团队将臭氧水应用于荷瘤小鼠局部，结果发现臭氧水局部应用对正常脏器功能无影响；与对照组相比，臭氧水局部应用组肿瘤坏死面积明显增大，且具有剂量依赖性[14]。周玉川等人[15]研究方法为获取人肝癌HepG2细胞在体外增殖、传代、对数生长期的细胞，实验组采用含浓度为0.5μg/ml的医用臭氧水的培养液处理细胞，观察细胞生长曲线、细胞凋亡情况、细胞迁移能力变化。结果体外实验结果显示，含臭氧的培养基中细胞数量明显减少，肿瘤细胞膜破裂，核固缩甚至裂解，臭氧对细胞的生长有抑制作用，同时CCK-8的检测结果显示臭氧能抑制肝癌细胞的增殖，Transwell迁移实验显示臭氧能抑制肿瘤细胞的迁移。Kuroda的研究团队将臭氧水应用于荷瘤小鼠局部，结果发现臭氧水局部应用对正常脏器功能无影响；与对照组相比，臭氧水局部应用组肿瘤坏死面积明显增大，且具有剂量依赖性[14]。提示臭氧水可诱导肿瘤坏死，抑制肿瘤细胞增殖。基于以上研究，我科前期研究[16]，以臭氧水腹腔灌注治疗癌性腹腔积液及晚期肿瘤患者，结果显示臭氧水可抑制恶性腹水的生长。

在欧洲，臭氧早已应用于腰椎间盘突出、关节炎、肩周炎疾病，创伤及难治性溃疡，抗自由基防衰老、中风及病毒性肝炎等疾病的治疗，其临床疗效得到了充分肯定。在医学发展的今天，逐渐研究出将更纯浓度的医用臭氧和不同的载体结合，形成臭氧水，臭氧自体回输血和臭氧气体的直接运用，臭氧可以在体内发挥其强氧化性。中晚期原发性肝癌多由慢性病毒性肝炎，肝硬化逐步发展而来。中晚期肝癌常常不同程度伴有恶性腹水形成。臭氧针对人体机体慢性缺氧，在有限的组织血液中提高氧浓度的作用，直接抑制和杀灭细菌、病毒，延缓肿瘤的发展，抑制肿瘤细胞的生长。因此，臭氧的治疗在中晚期原发性肝癌的治疗中有广泛的临床运用前景。