侵袭性大肠埃希菌IpaC的表达和纯化与检验学研究

刘庆权 荣 阳 刘晓华

（1 辽宁省辽阳市新城医院检验科，辽宁 辽阳 111000；2 辽宁省辽阳市中心医院医务处，辽宁 辽阳 111000；3 辽宁省辽阳市中心医院检验科，辽宁 辽阳 111000）

侵袭性大肠埃希菌（EIEC）是一种肠道侵袭性细菌，到目前已发现有12个“O”血清型，一些曾引起过腹泻的流行。目前的研究认为，EIEC的毒力取决于其侵入细胞的能力，其侵袭力与细菌的外膜蛋白有关，国外同仁先后证实EIEC的侵袭性质粒分子量为120～140 Md，该质粒可编码15种以上外膜蛋白，控制多种毒力因子，其中毒力蛋白IPaC是与侵袭过程中不可缺少的外膜蛋白[1]。所以本实验选择ipaC为靶基因，用基因工程的方法构建其重组表达质粒，表达并纯化毒力蛋白IpaC，为IpaC功能的研究奠定基础，从而进一步了解EIEC的发病机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料：质粒和菌株：EIEC、大肠杆菌BL21（λDE3）、表达质粒PET32a为本院检验科保存。主要试剂：QIAexpressionisTM蛋白纯化系统为德国QIA-GEN公司产品；异丙基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）为华美生物工程公司产品；咪唑购自Sigma公司；其他主要生化试剂为美国Sigma公司产品或国内AR级产品。

1.2 方法

1.2.1 表达载体的转化与基因产物的表达：将表达质粒Pet32a-ipaC转化用氯化钙处理法得到的感受态大肠杆菌EL21（λDE3），将转化液涂于含氨苄青霉素的LB平板上，37 ℃过夜培养。挑取单菌落接种于20 mL含氨苄青霉素的LB培养基中，37 ℃，200 r/min振摇过夜。取3 mL过夜培养物接种入100 mL的含氨苄抗性的LB培养基中，37 ℃以200 r/min振摇，测定A600值，直至A600值到达0.4～0.5（勿超过0.6）。加入IPTG（终浓度为0.4 μmol/L）进行诱导，诱导4 h后收菌。将菌液在4 ℃、5000 g、离心5 min，弃上清。将沉淀物用Lysis buffer液悬浮，反复冻融几次后，在冰浴中以中等强度超声破菌，每次45 s，每次间隔45 s，共10次。破菌后，4 ℃、15000 g，离心25 min，收集上清液备用。沉淀用同样的Lysis buffer溶解备用。

1.2.2 表达产物的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酞胺凝胶电泳（SDSPAGE）检测：收集IPTG诱导前与诱导后4 h的菌液各l mL，高速离心后分别用100 μL TE缓冲液悬浮、超声破菌离心后分别取上清和沉淀各100 μL，在上述样品中各加入100 μL的上样缓冲液混匀，100 ℃水浴3 min，点样，25 mA恒流通电进行SDS-PAGE。电泳后以考马斯亮蓝染色30 min，然后用脱色液脱色，观察结果。

1.2.3 表达产物的纯化：采用蛋白纯化系统进行纯化，操作方法按照说明书进行。用1 mL的resin slurry和4 mL的超声破菌后上清充分混合，200 rpm，4 ℃，60 min。将混合液过滤，收集流出液。4 mL wash buffer洗涤3次，并分别收集洗涤液。0.5 mL Eluton buffer洗脱4次，并分别收集洗涤液。将上述的收集液分别进行SDS-PAGE分析，观察蛋白纯化结果。将纯化后的蛋白在冻干机中冻干，保存备用。

2 结 果

2.1 重组质粒毒力蛋白IpaC的导诱表达以及表达产物的鉴定分析：将重组质粒pET32a-iPaC转化大肠杆菌BL21（λDE3），在IPTG诱导下表达，分别对诱导前后的表达产物进行SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色，可在相对分子量63KD处见一明显的诱导表达带。对此诱导表达带进行黑度密度自动扫描分析，此处表达蛋白量约占总菌体蛋白量的13%。

2.2 重组质粒表达产物的可溶性鉴定以及纯化结果：将超声破菌后上清和沉淀分别进行SDS-PAGE，发现目的蛋白同时存在于上清和沉淀中，表明该目的蛋白的表达有部分为可溶性表达，还有一部分蛋白形成了包涵体。如果仅从上清中提取目的蛋白，既可保证蛋白的天然活性，还可免去蛋白复性这一步，简化了纯化的过程。对纯化的蛋白进行黑度密度自动扫描分析，蛋白的纯度达到90%以上。

3 讨 论

EIEC是一种肠道侵袭性细菌，它侵入肠上皮细胞，在细胞内繁殖引起细胞变性，使肠上皮出现损伤，导致黏膜固有层发生炎症、溃疡、出血，但是具体的发病机制并不十分清楚。EIEC介导侵袭的基因位于大质粒一个25 kb的BamHl片段上[2]。该质粒可编码一组侵袭性毒力蛋白（IPa），它们分别是IpaA、IpaB、IpaC、IpaD，是细菌侵入肠上皮细胞所必需的。IPa蛋白抗体有被动免疫保护性作用，可阻断EIEC侵入肠上皮细胞，细菌不能侵入肠上皮细胞，即不具有毒性，说明IPa蛋白在抗感染过程中有重要作用[3]。

本实验选择的pET表达质粒系统是近年来出现的一种含T7启动子的原核表达系统，该系列质粒中含有脚启动子、多克隆位点、氨节青霉素抗性基因、表达产物的N端和（或）C端含有6个连续的组氨酸等。其中T7启动子可高效表达外源蛋白，所表达的外源蛋白质量一般占总蛋白量的25%以上，甚至达到细菌总蛋白量的50%[4]。采用Ni-NIA鳌合层析介质，以咪唑洗脱表达的外源蛋白。纯化过程非常简便，而且纯化蛋白的纯度可达到90%以上。所以该蛋白纯化体系是一种简便、高效的纯化系统[5]。

因此，本实验选择EIEC毒力质粒编码的侵袭性毒力蛋白基因（IpaC）作为研究对象，利用基因工程的方将该基因定向克隆到原核高效表达质粒pET32a中，并将重组质粒转化表达宿主菌BL21（λDE3），从而稳定、高效地表达毒力蛋白IpaC。可进一步研究该毒力蛋白的生化特性及免疫学功能，并进行体内外侵袭性功能研究，可以更好地了解EIEC的发病机制。

[1] 慕容洋洋,边彤,苏宁.侵袭性大肠埃希氏菌IpaC的表达和纯化与临床检验学研究[J].中华医学检验杂志,2015,38(1):33-36.

[2] 朱忠勇.实用医学检验学[M].北京:人民军医出版社,2008:301-309.

[3] 龙官保,刘华,苏畅.侵袭性大肠杆菌实验研究[J].中华医学检验杂志,2015,38(1):161-163.

[4] 徐建国.分子医学细菌学[M].北京:科学出版社,2008:145-149.

[5] 梁国栋.最新分子生物学实验技术[M].北京.科学出版社,2008:282-288.