二甲双胍联合膈下逐瘀汤对多囊卵巢综合征胰岛素抵抗大鼠TLR4/NF-κB信号通路的影响*

姜晓琳， 张立德， 滕 飞， 马贤德， 吕美君， 王 莹， 褚春莉

(辽宁中医药大学 1医院管理处门诊部， 2中医脏象理论及应用教育部重点实验室， 辽宁 沈阳 110032； 3辽宁省中医研究院， 辽宁 沈阳 110034)

多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)的临床表现为月经紊乱、肥胖，多毛和痤疮等症状。PCOS患者激素的长期紊乱可导致胰岛素抵抗(insulin resistance， IR)，诱发糖尿病[1]。育龄期妇女PCOS的发病率为5%～10%，胰岛素抵抗和高雄激素血症是其发生相关并发症及临床表现的核心因素，近年来的深入研究还表明， PCOS存在慢性炎症反应，且慢性炎症是相关并发症的始动因素，其能诱发胰岛素抵抗、卵巢多囊样改变和雄激素分泌升高等症状[2]。长时间的临床治疗经验积累显示，对该类患者进行药物干预治疗能很好地改善激素水平紊乱状态并缓解炎性反应等[3]。在慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)患者中的研究表明， Toll样受体4(Toll-like receptor-4，TLR-4)是一种天然免疫受体，被革兰阴性菌外膜脂多糖等刺激活化后，经过一系列磷酸化促进作用，它可激活核因子κB(nucler factor-κB，NF-κB)信号通路，从而调节各种炎症因子的表达[4]，而PCOS的启动因素恰恰是慢性炎症的长时间刺激[2]。在祖国医学中，PCOS多从肾虚血瘀来辩证，而化瘀是治疗PCOS必不可少的环节。膈下逐瘀汤(Ge Xia Zhu Yu decoction)为清代王清任《医林改错》中的药方，是活血化瘀的经典方剂。有报道显示，膈下逐瘀汤有改善微循环和盆腔环境、缓解盆腔组织粘连、抗炎止痛及调节内分泌的作用[5]；膈下逐瘀汤联合炔雌醇环丙孕酮片达英-35可以提高治疗多囊卵巢综合征的疗效[6]，但是没有对二甲双胍(metformin， Met)联合膈下逐瘀汤治疗PCOS的机制进行研究。本研究通过建立PCOS大鼠模型，进一步明确膈下逐瘀汤治疗PCOS的作用机制。

材 料 和 方 法

1 实验动物、试剂和仪器

1.1实验动物 选用160只近交系健康性成熟的Wistar雌性大鼠[辽宁中医药大学实验动物中心提供，动物合格证编号为SYZX(辽)-2015-0001；8～10 周龄， 210～230 g]构建PCOS大鼠模型，其中成功造模130只。造模成功的130只大鼠当晚禁食，次晨于尾缘静脉取血做空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)和空腹胰岛素(fasting insulin，FINS)检测，计算胰岛素抵抗指数(insulin resistance index, IRI)。IRI=FBG(mmol/L)×FINS(mU/L)/22.5[7]。以IRI>2.8[8]作为PCOS胰岛素抵抗动物模型建立成功的标志，共有130只大鼠造模成功。将130只大鼠随机分成模型(model)组(40只)、二甲双胍(Met)组(45只)及二甲双胍联合膈下逐瘀汤(combination)组(45只)，最后顺利完成研究的大鼠共110只(模型组30只，二甲双胍组40只，二甲双胍联合膈下逐瘀汤组40只)。各组大鼠的基线资料间差异无统计学显著性，见表 1、2。

1.2主要试剂 二甲双胍(原料药)由Bristol-Myers Squibb Company提供；注射用脱氢表雄酮为武汉华美科技集团有限公司产品；膈下逐瘀汤(桃仁9 g、红花9 g、当归9 g、川芎6 g、赤芍6g、香附4.5 g、枳壳45 g、乌药9 g、五灵脂6 g、元胡 3 g、丹皮6 g、甘草9 g)为辽宁中医药大学附属第一医院产品，中药饮片加入10倍量水，浸泡 2 h，煎沸 30 min，过滤取煎液，药渣加入8倍量水，煎沸 30 min，合并2次煎煮液后过滤，滤液浓缩至含生药 5.75 g/L，按人与大鼠药物剂量换算的等效剂量(34.5 mg·kg-1·d-1)给药[9-12]，浓缩水煎液， 4 ℃保存备用；注射用油剂为武汉顶辉化工有限公司产品；大鼠白细胞介素6(interleukin-6， IL-6) ELISA试剂盒、大鼠肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α， TNF-α) ELISA试剂盒和胰岛素ELISA试剂盒为武汉优尔生商贸有限公司产品；大鼠C反应蛋白(C-reactive protein， CRP) ELISA试剂盒和葡萄糖测试盒为上海浩然生物科技有限公司产品；免疫组织化学试剂盒为中杉金桥公司产品；RT-PCR试剂盒为TaKaRa产品；Trizol试剂为Invitrogen产品

表1 造模成功后进入研究的3组大鼠基线资料分析

2hPBG： 2-hour postprandial blood glucose.

表2 完成研究的3组大鼠造模前基线资料分析

1.3主要仪器 iMark酶标仪(BioTek)；RM2245型石蜡切片机(Leica)；7500 Real-Time PCR仪(Applied Biosystems)；BioSpec-nano型紫外可见分光光度计(岛津公司)；冷冻离心机(Thermo)；光学显微镜(Leica)；FA2004精密天平(上海佑科仪器仪表有限公司)；ASD-310S型低温离心机和ASD-310S型低温离心机(Sigma)；PCR仪(Biometra)。

2 实验方法

2.1PCOS大鼠动物模型的建立 将160只Wistar雌性大鼠适应性饲养2 周，每笼5只，人工控温(20～26 ℃)，12 h光照，12 h黑暗，颗粒饲料喂养，自由饮水进食；根据大鼠的体重将脱氢表雄酮按照0.6 mg/kg进行配制并注射，每日注射前用注射油剂将其稀释为0.2 mL，现用现配；将配制好的脱氢表雄酮注射液注射于大鼠颈背部皮下，每天注射一次，连续注射20 d[8], 后在光学显微镜下观察大鼠一个动情周期(连续4 d)的阴道涂片，以出现阴道上皮持续角化并失去完整的动情周期代表PCOS造模成功[8]。将造模成功的PCOS模型鼠当晚禁食，次晨于尾缘静脉取血做FBG和FINS检测， 计算IRI。

2.2PCOS大鼠的分组及处理 将130只造模成功的大鼠按照随机数字表法分为模型(model)组(40只)、二甲双胍(Met)组(45只)和二甲双胍联合膈下逐瘀汤(combination)组(45只)；根据人与大鼠体重比进行换算得出大鼠给药剂量， 模型组给予生理盐水灌胃；二甲双胍组给予二甲双胍粉末(270 mg·kg-1·d-1)灌胃(依据体重决定液体灌胃混悬液体积，灌胃前用0.9%氯化钠注射液配成30 g/L的混悬液)；二甲双胍联合膈下逐瘀汤组大鼠在给予二甲双胍基础上，再给予膈下逐淤汤(34.5 mg·kg-1·d-1)灌胃[9-12]，连续给药28 d(相当于7个动情期)。

2.3测定血清IL-6、CRP和TNF-α含量及FBG和餐后2 h血糖(2-hour postprandial blood glucose， 2hPBG)水平 干预结束后，将各组大鼠禁食24 h，次日清晨抽取腹腔静脉血检测FBG，抽取后立即给予2.5 g/kg的葡糖糖灌胃，120 min后再次抽取尾缘静脉血检测2hPBG。抽血后腹腔注射20%氨基甲酸乙酯溶液(0.05 mL/kg)麻醉，腹主动脉取血,离心取血清，用ELISA法测定各组大鼠血清中IL-6、CRP和TNF-α的含量，按照试剂盒说明书进行操作。

2.4RT-PCR测定NF-κB、TLR-4和氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein， ox-LDL)的mRNA表达 将留取的卵巢组织匀浆并按Trizol试剂盒说明书提取出总RNA。鉴定RNA纯度与完整性后按试剂盒说明以(oligo)dT为引物逆转录合成cDNA，以2 μL的cDNA为模板按试剂盒说明进行PCR扩增，反应条件为： 94 ℃ 1 min；Tm(根据不同模板而确定的退火温度)50 s， 72 ℃ 90 s，进行40个循环。扩增产物20 g/L琼脂糖凝胶电泳40 min，紫外灯(260 nm)下进行检测。用Quantity One软件分析各目的基因的条带密度，以管家基因GAPDH为内参照计算各个样本的基因条带密度的相对值，半定量后用均数和标准差形式表示。Marker由小到大依次是100、250、500、750、1 000和2 000 bp。各引物均由TaKaRa合成，GAPDH的上游引物序列为5’-CAAGGTCATCCATGCAAACTTTG-3’，下游引物序列为5’-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3’(496 bp)；NF-κB的上游引物序列为5’-AACGCAAA AGGACCTACGAGA-3’,下游引物序列为5’-GGATGTTGAAAAGGCATAGGG-3’ (161 bp)；TLR-4的上游引物序列为5’-GCCATTGCCAACATCATCC-3’，下游引物序列为5’-ACAATTCCACCTGCTGCCTCAG-3’(208 bp)；ox-LDL的上游引物序列为5’-CAACCAACCTGCAATCCTTT-3’，下游引物序列为5’-TGCAGCAACAGAAGGCATAC-3’(106 bp)。

3 统计学处理

采用SPSS 13.0软件对数据进行统计学处理。计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示，计数资料结果用百分数形式表示。计量资料组间均数比较采用方差分析；计数资料组间率的比较采用卡方检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 造模成功后的大鼠完成实验率及其退出研究原因分析

模型组、二甲双胍组和二甲双胍联合膈下逐瘀汤组完成率分别为75.00%、88.89%和88.89%，3组大鼠完成率差异无统计学显著性(χ2=4.104，P=0.129)，见表 2。其中，模型组治疗造模过程中5只(12.50%)大鼠因皮下感染导致死亡(长期注射导致背部皮下发生感染)，5只(12.50%)大鼠因灌胃导致食管损伤而导致死亡(进食差而出现死亡)；二甲双胍组大鼠2只(4.44%)大鼠因皮下感染导致死亡(长期注射导致背部皮下发生感染)，3只(6.67%)大鼠因灌胃导致食管损伤而导致死亡(进食差而出现死亡)；联合用药组大鼠3只(6.67%)大鼠因皮下感染导致死亡(长期注射导致背部皮下发生感染)，2只(4.44%)大鼠因灌胃导致食管损伤而导致死亡(进食差而出现死亡)。

2 造模前后阴道脱落细胞学观察(动情期变化)

造模前大鼠动情周期稳定，光学显微镜下阴道涂片观察可见成熟的角化脱落上皮，到动情前期出现有核上皮；造模成功后大鼠阴道角化和有核上皮数量均显著减少，以角化上皮减少为主，动情期间和动情期后白细胞增加，角化上皮脱落减少，动情期缩短，动情间期延长。

3 FBG、2hPBG及血清IL-6、CRP和TNF-α含量的变化

ELISA结果示， 干预结束后二甲双胍组和联合用药组两组大鼠FPG、2hPBG及血清IL-6、TNF-α和CRP浓度均低于模型组(P<0.05)，且联合用药组大鼠上述指标均低于二甲双胍组(P<0.05)，见表 3。

表33组大鼠干预后外周血糖、胰岛素及血清炎性因子水平比较

Table 3. Comparison of peripheral blood glucose, insulin and serum inflammatory factors in the 3 groups of rats after intervention (Mean±SD)

GroupnFBG(mmol/L) 2hPBG(mmol/L)IRIFINS(mU/L)IL-6(ng/L)TNF-α(ng/L)CRP(mg/L)Model305.54±0.737.34±1.313.87±0.4314.56±2.1234.42±8.6734.32±7.541.82±0.21Met404.86±1.12*5.41±1.12*3.23±0.73*13.21±1.56*28.57±7.21*18.32±2.54*1.31±0.24*Combination404.63±0.81*#5.22±0.72*#3.11±0.63*#12.11±1.78*#23.54±6.32*#13.54±3.21*#1.17±0.21*#

*P<0.05vsmodel group;#P<0.05vsMet group.

4 NF-κB、TLR-4和ox-LDL的mRNA表达水平的变化

RT-PCR结果显示，干预结束后二甲双胍组和联合用药组大鼠卵泡上皮NF-κB、TLR-4和ox-LDL的mRNA表达水平均低于模型组(P<0.05)，且联合用药组大鼠卵泡上皮NF-κB、TLR-4和ox-LDL的mRNA表达水平均低于二甲双胍组(P<0.05)，见图1、表4。

讨 论

在祖国医学中，PCOS归属于月经量少、闭经、不孕和癥瘕等疾病范畴，其病机为肝脾肾功能失调、气滞血瘀和痰湿阻滞。膈下逐瘀汤中，桃仁、红花、当归、川芎和赤芍可活血化瘀，现代药理研究认为其可以抑制血小板聚集，防止血栓产生；香附、枳壳和乌药可理气行滞，现代药理研究认为其可以抗菌抗炎；香附、五灵脂和元胡可活血止痛，现代药理研究认为其可以调节内分泌，增强机体抵抗力[5]。

Figure 1. The changes of mRNA expression levels of NF-κB, TLR-4 and ox-LDL.

图1NF-κB、TLR-4和ox-LDLmRNA表达水平的变化

表43组大鼠干预后卵巢组织NF-κB、TLR-4和ox-LDL的mRNA表达水平

Table 4. The mRNA expression levels of NF-κB, TLR-4 and ox-LDL in rat ovarian tissue after intervention (Mean±SD)

GroupnNF-κBTLR-4ox-LDLModel300.68±0.120.73±0.110.51±0.11Met400.43±0.10*0.62±0.10*0.32±0.08*Combination400.22±0.08*#0.42±0.08*#0.26±0.07*#

*P<0.05vsmodel group;#P<0.05vsMet group.

近年来，现代医学对PCOS的研究认为其是一种亚临床炎症反应，这种亚临床炎症反应可损伤胰岛β细胞，进而损伤卵巢而导致多囊样改变及激素分泌异常，因此改善炎症反应成为治疗PCOS的研究热点[13-15]。有报道显示，卵巢组织中TLR-4/NF-κB信号通路在PCOS胰岛素抵抗的发病过程中扮演了重要角色[16]。TLRs 是人类先天性免疫识别受体的重要组成部分，是唯一能将细胞外抗原信息向细胞内传递的跨膜蛋白[17]；ox-LDL 是 TLR-4的内源性配体。TLRs 与ox-LDL结合后，激活NF-κB，产生 IL-6和TNF-α 等炎症因子。NF-κB 属转录因子家族成员，是主导炎症发生、发展的关键因子。因此，抑制NF-κB的活性，降低 TLR-4和ox-LDL 的表达，可能是药物治疗PCOS 的有效途径。本研究通过建立PCOS大鼠模型进行研究，将二甲双胍与膈下逐瘀汤联合使用进行药物治疗干预，以证实2种药物联合能否通过NF-κB/TLR-4信号通路起到治疗PCOS的目的。结果显示，治疗28 d后，二甲双胍与膈下逐瘀汤联合使用， 能减少NF-κB活化，降低TLR4和ox-LDL的表达，减轻IL-6和TNF-α分泌，与模型对照组和二甲双胍单用组比较，差异均有统计学意义。因此，膈下逐瘀汤可能是通过减少NF-κB活化入核，降低TLR-4和ox-LDL表达，减轻IL-6和TNF-α的分泌，起到了治疗PCOS的作用。此外，通过对炎性因子浓度的监测，IL-6和TNF-α浓度的降低，也降低了NF-κB的活化入核，两者形成的良性循环，使PCOS的症状得到了较好的控制。

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