外源性硫化氢对肝细胞NLRP3炎症小体的影响*

王红钢， 孙伟力， 钟培育， 吴东栋， 王 军， 蔡 欢， 王国英， 乔 玲， 张 涛， 李彦章

(1河南大学基础医学院， 2河南大学民生学院， 河南 开封 475004)

炎症小体(inflammasome)是机体免疫系统的组成成分,是一种多蛋白复合体，可识别病原微生物和内源性危险信号，即病原相关分子模式和损伤相关分子模式等蛋白复合物，通过激活半胱氨酸天冬氨酸酶-1(caspase-1)，诱导促炎因子白细胞介素-1β和白细胞介素-18成熟和分泌，调控炎症反应，抵抗病原体感染和应激损伤，但其过度活化可导致组织器官炎症损伤[1-2]。其中NLRP3炎症小体由NOD样受体家族成员NLRP3、接头蛋白ASC和pro-caspase-1组成，是目前研究最多最透彻的炎症小体。已确认NLRP3炎症小体在很多疾病的炎症发生发展中起重要作用，因此，NLRP3炎症小体已成为众多炎症疾病治疗药物开发的探索靶点。

硫化氢(hydrogen sulfide，H2S)是哺乳动物体内一种重要的气体信号分子，在脂代谢和心肌细胞损伤等生理病理过程中起重要作用，其在哺乳动物体内以半胱氨酸为底物，在胱硫醚γ-裂解酶(cystathionine γ-lyase，CSE)、胱硫醚β-合酶(cystathionine β-synthase，CBS)和3-巯基丙酮酸硫基转移酶(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase，3-MST)的催化下产生[3-4]，具有重要的抗炎作用[5]。目前，H2S在炎症中的作用已被广泛研究，但其与NLRP3炎症小体的关系鲜见报道，本文用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激人肝细胞L02和SMMC-7721建立炎症模型，用硫氢化钠(sodium hydrosulfide hydrate，NaHS)释放外源性H2S施加干预来研究H2S对NLRP3炎症小体的影响，以期为研发NLRP3炎症小体靶向的抗炎药物提供理论依据。

材 料 和 方 法

1 实验材料

L02细胞和SMMC-7721细胞购自上海纪宁实业；DMEM和胎牛血清购自Gibco；脱脂奶粉购自北京鼎国生物公司。

2 实验方法

2.1细胞分组 将细胞分为4组：对照(control)组、LPS组、LPS+NaHS组和NaHS组。对照组用普通培养基培养18.5 h；LPS组用普通培养基培养0.5 h后，再用LPS(100 μg/L)刺激18 h；LPS+NaHS组用NaHS(200 μmol/L)刺激0.5 h后，再用LPS刺激18 h；NaHS组用NaHS(200 μmol/L)刺激0.5 h后，再用普通培养基培养18 h。

2.2MTT法检测不同浓度LPS对两种肝细胞细胞活力的影响 将肝细胞以1×107/L的浓度接种于96孔板中，每孔0.2 mL，每个浓度设置3个复孔，周边孔不加液体以去除边缘效应，培养24 h后将培养液换为含不同浓度(0、100、200、500和1 000 μg/L)LPS的培养基诱导肝细胞18 h后，每孔加入5 g/L的MTT溶液 20 μL，培养4 h后弃掉培养液，每孔加入150 μL DMSO振荡5 min，然后在酶标仪上测定570 nm处的吸光度(A)值，细胞活力(%)=(处理组A值/对照组A值)×100%。重复上述实验3次。

2.3Western blot实验 弃去6孔板中的培养基，用冷的PBS清洗细胞3遍，然后每孔加入200 μL RIPA裂解液，混匀后室温静置10 min，然后将细胞转移至1.5 mL的离心管中，在冰上振荡裂解5 min，然后12 000×g、4 ℃离心，将上清转移至另一个新的1.5 mL的离心管中，按照BCA试剂盒说明检测蛋白浓度。检测后的蛋白样品经变性处理后用于SDS-PAGE。电泳结束后将胶放在转膜液中平衡10 min，然后组装成“三明治”的形式，100 V、转膜45～60 min，完成后取出PVDF膜，用TBS清洗10～15 min。 I 抗(NLRP3和caspase-1)用含有脱脂奶粉的TBST稀释(1∶1 000)，加至PVDF膜室温孵育2 h，然后用TBST缓冲液洗PVDF膜3次，每次10 min，再加入HRP标记 II抗(1∶1 000稀释)室温孵育2 h，然后用TBST缓冲液洗PVDF膜3次，每次10 min，加入显色液照相保存结果。

3 统计学处理

采用GraphPad Prism 5统计软件进行统计分析。数据以均数±标准差(mean±SD)表示，采用t检验分析两组均数间的差异，采用单因素方差分析检验多组均数间的差异，以P<0.05 表示差异有统计学意义。

结 果

1 不同浓度LPS对细胞活力的影响

为确定建立炎症模型所用LPS是否对细胞活力有影响，本实验用不同浓度的LPS分别刺激L02细胞和SMMC-7721细胞18 h后，用MTT法检测细胞活力。结果显示，与对照组(0 μg/L LPS)相比，浓度100～500 μg/L 的LPS对2种肝细胞均无毒性作用，见图1。

2 不同浓度LPS对胞内NLRP3炎症小体表达的影响

为检测LPS的促炎效果，本实验用不同浓度的LPS刺激L02细胞和SMMC-7721细胞18 h后，用Western blot 检测NLRP3炎症小体的表达。结果显示，与对照组相比，用浓度为100 μg/L的LPS刺激细胞，NLRP3和caspase-1在两种细胞中的表达均明显增强(P<0.05)，见图2、3。综合以上的实验结果，本实验选择LPS的浓度为100 μg/L。

Figure 1. MTT assay was used to measure the effect of LPS at different concentrations on the viability of SMMC-7721 cells and L02 cells. Mean±SD.n=3.△P<0.05vs0 μg/L.

图1不同浓度LPS对SMMC-7721细胞和L02细胞活力的影响

Figure 2. Western blot was used to determine the effect of LPS at different concentrations on the protein expression of NLRP3 and caspase-1 in L02 cells. Mean±SD.n=3.△P<0.05vs0 μg/L.

图2Westernblot检测不同浓度LPS对L02细胞NLRP3和caspase-1蛋白水平的影响

Figure 3. Western blot was used to determine the effect of LPS at different concentrations on the protein expression of NLRP3 and caspase-1 in SMMC-7721 cells. Mean±SD.n=3.△P<0.05vs0 μg/L

图3Westernblot检测不同浓度LPS对SMMC-7721细胞NLRP3和caspase-1蛋白水平的影响

3 外源性H2S对细胞中NLRP3炎症小体的影响

本实验用NaHS作为H2S的释放剂，Western blot结果显示，与对照相比，LPS组的NLRP3和caspase-1表达明显增高，而LPS+NaHS组中的NLRP3和caspase-1表达比LPS组明显降低(P<0.05)，见图4、5。

Figure 4. Western blot was used to determine the effect of exogenous H2S on the expression of NLRP3 inflammasome in SMMC-7721 cells. Mean±SD.n=3.△P<0.05vscontrol group；*P<0.05vsLPS group.

图4外源性H2S对SMMC-7721细胞中炎症小体NLRP3蛋白表达的影响

Figure 5. Western blot was used to determine the effect of exogenous H2S on the expression of NLRP3 inflammasome in L02 cells. Mean±SD.n=3.△P< 0.05vscontrol group;*P<0.05vsLPS group.

图5外源性H2S对L02细胞中炎症小体NLRP3表达的影响

讨 论

LPS是革兰氏阴性菌表达的内毒素，可识别Toll样受体4，激活炎症信号通路，上调NLRP3炎症小体的表达[6-7]。采用LPS刺激产生炎症是常见的建立炎症模型的方法，本文MTT结果显示低浓度的LPS可不明显地升高肝细胞活力，但高剂量的LPS会对细胞活力有显著抑制作用，综合Western blot结果确定后续实验所用LPS浓度为100 μg/L。

H2S是哺乳动物体内继一氧化氮和一氧化碳之后被发现的第3种气体信号分子，以前一直被认为是有毒气体，但近年来研究发现，H2S具有重要的抗炎作用。研究表明，给予外源性H2S可明显改善缺血引起的心肌炎症损伤，减少炎症介质的释放[8-9]，外源性H2S还可抑制LPS诱导的大鼠原代心肌细胞炎症介质的产生[10]，通过抗炎作用减轻缺血再灌注引起的胃黏膜细胞损伤[11]。虽然近年来有关H2S的研究很多，但在人肝细胞中，关于H2S与NLRP3炎症小体的研究还鲜见报道。近年来研究表明，NLRP3在肝炎过程中发挥重要作用，用半乳糖神经酰胺诱导野生型小鼠和NLRP3敲除小鼠建立炎症模型，结果显示在NLRP3敲除小鼠中，肝细胞中的IL-6 和TNF-α等炎症介质以及血浆中的丙氨酸转氨酶比野生小鼠显著减少[12]，持续的乙型肝炎病毒感染可抑制肝细胞中NLRP3炎症小体的表达，加重肝脏损伤[13]。本文在L02细胞和SMMC-7721细胞炎症模型的基础上研究H2S对胞中NLRP3炎症小体的影响，结果显示给予外源性H2S后，细胞中炎症小体NLRP3和caspase-1表达均显著减弱，初步证明外源性H2S可抑制人肝细胞中LPS诱导的NLRP3炎症小体的表达，说明H2S具有作为抗炎药物的潜在价值，本实验是一系列研究的起始，H2S是否显著降低炎症小体NLRP3活化之后的下游产物水平？H2S是通过何种信号转导途径抑制炎症小体NLRP3表达的？这一系列问题还有待后续进一步研究，若上述问题被解决，有望为H2S相关药物的研发提供一定的理论基础。

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