蛋白质组学技术在畜禽遗传育种中的应用与展望

徐 哲， 李佳霄， 徐琳娜， 贺 花，杨 鹏， 雷初朝， 陈 宏， 黄永震*

(1.西北农林科技大学动物科技学院,陕西 杨凌 712100;2.甘肃省畜牧业产业管理局，兰州 730000；3.西北农林科技大学动物医学学院,陕西 杨凌 712100)

前 言

随着人类基因组序列的完成，生命科学研究由基因组时代进入了后基因组时代。随着研究的深入，人们发现基因组学存在一定的局限性，于是更加贴近生命活动本质的蛋白质组学应运而生。蛋白质组学是后基因组学的一个重要组成部分，也是当前分子生物学领域研究的热点。随着相关技术的日臻成熟，近年来蛋白质组学已在多个领域的分子水平研究中发挥重要作用。本文就当前蛋白质组学在家畜家禽生产、人类疾病等方面的应用及现状进行综述并分析其发展趋势，以期对利用蛋白质组学工具的研究者有所启发。

1 蛋白质组学概述

“蛋白质组学”一词最初由澳大利亚Macquaie大学的Wilkins和Williams于1994年提出[1]，最初定义为“一个基因组所表达的蛋白质”。综合考虑了蛋白质组的动态性和易受环境影响性,目前认为蛋白质组是一个已知的细胞在某一特定时刻的包括所有亚型和修饰的全部蛋白质[2]。蛋白质组学就是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，提示蛋白质的功能与细胞的活动规律[3]。蛋白质组研究填补了基因组研究的空白，在蛋白质水平上定量、动态、整体性地对生物体进行研究。蛋白质组研究数据与基因组数据相结合，将在以后的研究中发挥重要作用。

2 蛋白质组学关键技术

蛋白质组学的发展依靠一整套技术，按其流程可分为以下几类。

2.1 蛋白质分离技术

蛋白质样品制备是蛋白质组研究的第一步，也是后续研究的基础。蛋白质样品制备包括以下步骤：对细胞、组织等样品进行破碎、溶解、失活和还原，断开蛋白质之间的连接键，提取全部蛋白质，去除非蛋白质部分[4]。样品制备过程中要注意防止蛋白丢失，减少蛋白降解，降低各种非目标性蛋白修饰，保证清除所有杂质。目前常用制备方法有：硫酸铵沉淀法、三氯乙酸(TCA)沉淀法、丙酮沉淀法、TCA-丙酮沉淀法等。分离技术是蛋白质组学研究的核心技术。目前研究中常用方法有：双向凝胶电泳、高效液相层析(HPLC)、亲和层析、毛细管电泳等[5]。

2.2 蛋白质鉴定技术

传统的蛋白质鉴定技术包括Edman降解法测序和氨基酸组成分析。Edman降解法测序可得到准确的肽序列，但存在测序速度较慢、费用偏高等缺陷。随着近年来不断改进，Edman降解法在测序速度和灵敏度上都有了很大提高，应用范围也有所拓展[6]。氨基酸组成分析法是利用不同蛋白质具有特定的氨基酸组分的特征来鉴定蛋白质。该方法耗资低，但速度较慢，所需蛋白质或肽的量较大，在超微量分析中受限，且存在酸性水解不彻底或部分降解而产生氨基酸变异的缺点，一般需结合蛋白质的其他属性进行鉴定。

质谱分析技术与传统的蛋白质鉴定方法相比具有灵敏、准确、高通量、自动化等优点。该方法可达到对蛋白质的快速鉴定和高通量筛选，还能用于翻译后修饰(糖基化、甲基化)的分析。但质谱分析技术仍具有固有的局限性，比如不能区分Ile、Lys和Gln，有些肽固有序列不能测定等。

同位素标记亲和标签技术(ICAT)是目前蛋白质组研究的核心技术之一，主要是用来研究不同蛋白质组间的差异。这种方法具有较高的灵敏度和准确性，低表达的蛋白质也可分析,它还可以直接测试混合样品，并快速定性和定量鉴定低丰度蛋白质，同时快速找出重要功能蛋白，在蛋白质组研究中有巨大的应用价值[4]。

2.3 蛋白质相互作用的研究

酵母双杂交系统是分析蛋白质相互作用的一种有效方法，可大规模用于蛋白质间相互作用的研究，且具有易于自动化高通量等特点，但存在假阳性和假阴性的现象。噬菌体展示技术是在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的基因序列技术。该技术有高通量及简便的特点，弥补了酵母双杂交技术的一些限制。

2.4 生物信息学

随着2-DE的发展，蛋白质数据库自1996年也逐步发展起来。目前应用于蛋白质组学研究的数据库主要有SMSS-PROT、BLOCKS、SMART、PROSITE、WORLD-2DPAGE、EMBL、GenBank、DDBJ、ProClass、PRINTS、MASCOT、PROTOMAP、DOMO、PDB、NCBI等。

3 蛋白质组学的应用

3.1 蛋白质组学在动物遗传改良方面的研究

3.1.1 蛋白质组学在牛方面的研究 牛肉以其独特的风味和丰富的营养成分深受人们的欢迎，也推动了牛肉肉质在分子水平上的研究，蛋白质组学研究就是其中一种检测、控制并最终提高肉质的手段。其中，Bouley和Chambon等[7]利用2-DE和质谱分析法绘制出了牛科动物半肌腱肌肉的蛋白图谱，并定位出129个蛋白，其中很大一部分已被证实与细胞代谢有关，这为研究动物死后蛋白质对其肉质变化的控制机制打下基础。Jia等[8]利用2-DE技术牛胸部最长肌肌浆蛋白，在活体和刚刚屠宰的嫩肉中发现大量的具有抗氧化作用的Peroxiredoxin-6，并提出可将其作为检测肉质嫩度的指标。

牛奶中含有人体所需的所有必需氨基酸，且含有多种矿物元素，钙磷比例适宜，是人体钙的最佳来源。随着蛋白质组学技术的快速发展，人们对于乳蛋白的研究也进一步深入。Etske等[9]通过对糖基化修饰的研究发现，奶牛个体奶样中κ-酪蛋白基因的多样性及糖基化的κ-酪蛋白在奶样乳蛋白中所占的比例可影响酪蛋白微团的平均大小，且酪蛋白微团平均直径的大小与糖基化的κ-酪蛋白浓度大小成反比关系。这可能会为揭示出乳腺中经糖基化翻译后修饰的κ-酪蛋白群与酪蛋白微团形成的关系奠定基础。Holland等[10]利用2-DE从牛乳中提取并定性出κ-酪蛋白，并检测出其具有的5个Ο-糖基化的位点。Mollé等[11]通过ESI和MALDI离子化的方法提高了蛋白质定性结果的准确程度，共高分鉴定了39种牛乳蛋白质。Affolter等[12]研究了牛乳中乳脂肪球膜(milk fat globule membrane，MFGM)组分，对牛乳清蛋白的浓缩物(whey protein concentrate，WPC)以及牛乳蛋白的浓缩物(milk protein concentrate，BMP)分别进行了蛋白质组学分析，通过鸟枪法与液质联用结合的方式在WPC中鉴定出244种蛋白，在BMP中共鉴定出133种蛋白。Ciavardelli等[13]利用电感耦合等离子体质谱法分析了牛乳中α-酪蛋白和β-酪蛋白中的磷酸化位点，使牛乳酪蛋白磷酸化位点的研究逐渐成为乳中酪蛋白组学研究的核心。

在牛的健康问题上，从经济和生产的角度而言，对牛健康危害最大的疾病是奶牛的乳房炎和肉牛的布氏杆菌病、结核病及沙门氏菌病。Timothy等[14]利用同位素相对标记与绝对定量技术(iTRAQ)检测被金黄色葡萄球菌感染的奶牛所产的奶中蛋白质与健康奶牛乳汁蛋白的不同。目前共发现2 971种乳蛋白，其中有300多种蛋白被证明与宿主的防御系统有关，其中94种差异表达的机体防御蛋白在乳清、乳脂肪球膜和外来体三部分中分别选择性表达。杨永新[15]、Reinhardt等[16]学者们在蛋白质组水平上研究亚临床和临床乳房炎的奶牛抵御不同病原体的反应，并筛选了潜在蛋白质为生物标记，为进一步研究乳房炎的发病机理提供了方向。牛布氏杆菌是一类革兰氏阴性短小杆菌，可引起母畜传染性流产。在牛布氏杆菌的研究方面，利用免疫蛋白质组学技术筛选布鲁菌高免疫原性膜蛋白作为DNA疫苗的免疫抗原候选分子是预防此病的新途径。郭振华等[17]对牛种布鲁氏菌弱毒疫苗株s19与构建株△s19全菌蛋白的比较蛋白质组进行了研究。赵永坤等[18]对感染牛布鲁菌544A的巨噬细胞蛋白质组学进行了分析。

3.1.2 蛋白质组学在羊方面的研究 羊毛在纺织业中占据重要的位置，羊绒更是一种珍贵的纺织原料，一直被称为纺织纤维中的“软黄金”，曾在交易中以克论价。蛋白质组学技术在羊毛羊绒的研究中也起到了重要作用。Plowman[19]采用2-DE技术获得羊毛蛋白图谱，研究得出，一些来自于热休克蛋白(HSPs)的B2A家族的蛋白质可能与羊毛的卷曲度有关。杨洁等[20]应用软件分析不同细型细羊毛的2-DE凝胶图谱，检测出差异蛋白，对于通过调控这些差异蛋白来控制羊毛纤维直径意义重大。杨娇馥等[21]利用酵母双杂交技术和免疫共沉淀技术鉴定了绒山羊黏附斑激酶(FAK)与TSC2基因之间具有直接作用关系，且确定了它们相互作用的区域。Youngmi等[22]利用基质辅助激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)获得蛋白指纹，定性鉴别羊绒和牦牛毛纤维的不同，发现有3个离子峰为羊绒纤维所特有，质荷比分别为2 036、2 634和3 266，而质荷比为2 530和2 519的2个离子峰可用作牦牛毛的指纹离子。这为区分羊绒纤维和牦牛毛纤维提供了方法。

蛋白质组学在羊疾病中的应用较为有限。Yang等[23]应用蛋白质组学技术，利用患急性布鲁氏菌病患者血清，鉴定了羊种布鲁氏菌16M株的可溶性免疫反应性蛋白。孔汉金[24]首次应用了同位素标记相对和绝对定量联合二维液相色谱串联质谱技术体外分析被羊口疮病毒感染后的山羊皮肤成纤维细胞中蛋白质组学变化，发现了差异表达的蛋白与新陈代谢等反应过程有关。

3.1.3 蛋白质组学在猪方面的研究 肌肉中的纤维类型与肉质之间存在密切的关系，而肌纤维类型又与其蛋白组成的多样性和特异性有关。Bouley等[25]在研究蛋白质组模型时，在骨骼肌纤维中发现了肌生成抑制素蛋白基因(MSTN)中11个碱基对的缺失突变，这个突变导致正常水平的无活性肌生成抑制蛋白的表达，该基因的表达可加快肌肉细胞的增长。Hatam和Sandra等[26]则利用iTRAQ同位素标记蛋白定量技术，完成了猪骨骼肌中542个蛋白质耳朵鉴定，其错误率低于5%，该实验的成功标志着蛋白质组学在肉质检测应用中已日臻成熟。

在猪的疾病研究方面，刘永杰等[27]首次利用蛋白质组学技术研究BHK-21细胞被AsiaⅠ型口蹄疫病毒(FMDV)感染后蛋白质组的差异，结果发现病毒与细胞相互作用引起了细胞蛋白质组表达模式的改变，这为揭示该病毒的致病机理提供了线索。陈焕春等[28]利用蛋白质组学技术研究了曾引起人发病死亡的2型猪链球菌(SS2)在37 ℃(对照条件)和42 ℃(猪发病条件)培养条件下的分泌蛋白图谱差异，并鉴定了5个差异蛋白，为揭示SS2的致病机理、筛选药物靶标以及新型疫苗的研究提供了部分依据。王娜等[29]利用蛋白质组学技术分析了猪繁殖与呼吸综合症病毒071030株和福州株接种Marc-145细胞后蛋白质组学差异，为进一步研究PRRSV毒株间的致病力差异提供了分子基础。

3.1.4 蛋白质组学在鸡生产方面的应用 蛋白质组学技术的快速发展对于阐明鸡蛋中蛋白质的起源、改进鸡蛋生产环节、提高其营养价值和工业价值都有重大的意义和作用。Megan等[30]通过研究发现在禽类蛋壳最外层的角质层上有大量未被发现的抗菌的蛋白质成分，可防止外界微生物对蛋内环境的干扰。Sun等[31]利用无标记的蛋白定量质谱分析法对在同一子宫流体中作用下形成的高强度蛋壳和低强度蛋壳中的基质蛋白质丰度进行比较分析，发现决定蛋壳强度的因素有可能会是蛋白丰度。Wang等[32]通过对原鸡鸡蛋、正常白壳蛋、正常褐壳蛋等6种鸡蛋中的蛋白成分做了对比分析，发现有19种高丰度蛋白在6个蛋品种中具有显著差异。该研究进一步说明了蛋白的含量才是区分不同蛋品种的决定因素。Larbi等[33]通过对处于无菌环境、无特定病原体环境和正常环境的母鸡所产蛋中蛋清蛋白抗性进行对比研究，得出在排卵孵化期辅以适度的外界细菌刺激会使鸡蛋的免疫能力加强的结论。Sophie等[34]对孵化12 d后的受精蛋和非受精蛋的卵黄蛋白成分含量的变化进行了研究，发现69种蛋白在2种情况下都出现含量差异，这对孵化过程中胚胎蛋白的变化和食用蛋储存过程中蛋白质变化的研究都有一定的借鉴作用。

3.2 蛋白质组学在人类疾病中的应用

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)又名震颤麻痹，是一种与年龄相关的发生于锥体外系的神经系统变性疾病，临床症状为静止性震颤、运动迟缓、肌僵直和姿势步态异常等。PD被认为是一种脑蛋白处理障碍性疾病，要全面深入疾病现象及防护作用机制，必然要在整体蛋白质网络水平上对参与的蛋白质进行研究。Basso等[35]对PD患者黑质致密部进行了蛋白质组学研究，发现线粒体中锰超氧化物歧化酶和二氢化喋啶还原酶增加。在进一步研究中，鉴定了44个蛋白质，其中9个在PD患者中发生了差异性表达。Wemer等[36]在PD患者黑质致密部鉴定了16个差异表达蛋白，表明氧化应激参与PD的病理学改变。Yingjun等[37]通过同位素标记定量蛋白质组学在PD患者黑质中鉴定出11个差异表达蛋白，其中α-B晶状体蛋白(Cryab)明显上调，提示Cryab可能与在PD患者多巴胺能神经元退变过程中神经胶质的病理学改变有关。

炎症性肠炎(inflammatory bowel disease，IBD)是一种自身免疫性疾病，由诸多原因共同作用而致病。利用蛋白质组学及其相关技术来研究IBD，有利于IBD特异性标志物的筛选、IBD治疗靶点的确定以及判断其病情发展情况，进一步了解IBD的发病机制，为其诊断、治疗、预后带来新的思路。Hatsugai等[38]选入17例溃疡性结肠炎(UC)患者，13例克罗恩病(CD)患者和17名健康对照者，对其外周血细胞中的蛋白质进行对比分析。结果发现276个蛋白点能明显区分UC和CD患者，更进一步选择58个蛋白点对于鉴别疾病具有较高的优越性。Chen等[39]使用大肠杆菌蛋白质组芯片作为筛选和鉴定IBD血清标志物的蛋白质组学方法，最终确定了2套血清抗体，分别为区分CD患者与健康对照组的新型生物标记物，CD患者与UC患者的新型生物标记物。康亮等[40]选入4例CD患者和4名正常成年人，将其血清样品进行蛋白质组学分析，发现CD患者血清样品中胶号为973的蛋白点过表达，用质谱鉴定为CD45，提示CD患者血清样品中CD45的过表达可能在免疫系统失衡中发挥一定作用。

作为世界五大绝症(运动神经元症、癌症、艾滋病、白血病、类风湿)之一，癌症已成为全世界人类最大的致死原因，其日益增长的发病率和高死亡率也推动着蛋白质组学在癌症方面的研究。Kageyama等[41]对获得的癌变和非癌变膀胱上皮组织样品用定量Western blotting技术进行比较，分析显示CRT在膀胱癌组织中增加，说明CRT可能作为检测膀胱癌的标志物。Ye等[42]通过2-DE联合基质辅助激光解析电离飞行时间串联质谱技术分析人原发性肝癌组织与正常人体肝脏组织之间的蛋白差异，发现了如磷脂酰乙醇胺结合蛋白1等差异蛋白，有助于对肝癌发生机制的研究及预测治疗。Chan等[43]采用2-DE和质谱分析比较了96例胃癌患者根治性胃切除手术前后以及32例胃溃疡患者和52例健康体检者的血清淀粉样蛋白A(SAA)水平，发现胃癌患者SAA水平显著高于健康体检者和胃溃疡患者，且与肿瘤分期和部位有关。

4 前景与展望

近年来，蛋白质组学作为一门新兴学科，虽然刚刚起步，却为大规模直接研究基因功能提供了强有力的工具。目前，蛋白质组学在农业科学研究的多个领域得到初步应用，但低丰度蛋白的获得和植物蛋白的定量仍然是一个巨大的挑战。蛋白质组学不仅为阐明生命活动规律提供物质基础，也能为探讨重大疾病的机理、疾病诊断、疾病防治和新药开发提供重要的理论依据和实际解决途径，解决了在蛋白质水平上大规模直接研究基因功能的问题。因此，要不断加强国际间的学术合作及资源交流，建立全球共享的数据库系统，最终揭示基因组的结构与功能。随着蛋白质组研究的深入发展，相信蛋白质组学必将在农业、医药开发等领域有重大突破。