神经肽Y在骨微损伤修复机制中的作用

谢玮鑫 王双磊 李展春

上海交通大学医学院附属仁济医院骨科，上海 200127

骨微损伤是指骨疲劳导致的骨显微结构改变的结果[1]，骨的周期性和疲劳性负载可引起骨微损伤以及微损伤的聚积，最终发生骨折。骨骼具有自我修复的能力，大量实验通过诱导微损伤形成来研究其修复机制，发现骨组织可对微损伤进行“靶向重建”[1-3]，因此研究骨微损伤的修复机制对于骨质疏松性骨折的早期诊断与治疗有着重要意义。近年来，越来越多的神经肽被发现对骨代谢有调节作用，其中神经肽Y(neuropeptide Y, NPY)在骨重建过程中起到重要作用。本文综述了NPY在骨微损伤修复机制中的作用，旨在为相关深入研究以及骨质疏松骨折的早期诊断与治疗提供一定的理论基础。

1 骨重建在骨微损伤修复中的作用

骨重建包括两个重要的步骤：破骨细胞介导的骨吸收以及成骨细胞介导的骨形成[4-6]。成人骨重建在骨吸收以及骨形成之间需要一个精确的平衡[7,8]，如果两者失衡，如骨吸收超过了骨形成的代偿，就会导致骨质疏松[9]。

研究表明骨组织通过启动骨重建来修复骨微损伤[2, 10]。Bentolila等[10]在对鼠尺骨施加疲劳负载后观察发现，10 d后骨微裂缝的数量密度较之前减少了40%，Allen等[11]报道了在使用双膦酸盐抑制了40%～50%的骨重建之后导致损伤区域扩大3倍，并且Allen等[12]还发现通过雷洛昔芬更轻微地抑制20%的骨重建之后出现了双倍的微裂缝数量，提示骨重建的抑制程度才是微损伤修复的首要问题。可以看出骨重建在骨微损伤修复中有着重要的作用。

Bentolila等[10]通过鼠尺骨疲劳模型研究首先提出不同微损伤类型对骨重建的影响不同，后来的多项研究也发现线性微损伤可启动骨重建，而弥漫性微损伤没有骨重建活动或微裂缝修复有效性显著低于线性微裂缝[2, 10]，近年来，Herman等[1]的研究也支持上述结论。线性微损伤启动骨重建的机制目前尚未明确，骨细胞凋亡被认为是线性裂纹启动骨重建的一个重要机制。Kennedy等[13]研究发现骨微损伤区域的吸收陷窝内出现大量凋亡骨细胞，并且这些凋亡细胞对于骨重建有重要意义。Herman等[1]研究发现骨疲劳负载后药物抑制骨细胞凋亡可以阻止骨重建的激活，Tami 等[14]认为线性微损伤影响局部骨细胞间小管液的运输，从而引起骨细胞缺氧应激而导致骨细胞凋亡。Cheung等[15]与Kennedy等[16]认为这些凋亡骨细胞可以促进邻近正常骨细胞释放破骨细胞募集因子如RANKL等，从而激活骨重建。另外，小管液的渗漏可能伴随类似破骨细胞趋化因子的释放而募集破骨细胞，从而启动骨重建[17]。综合以上研究，骨细胞凋亡在微损伤启动骨重建过程中起到重要作用，线性损伤可能通过周围局部骨细胞的凋亡激活破骨细胞在骨微损伤区域去除损伤的骨基质，启动骨重建。

2 NPY系统在骨重建中的作用

NPY 是一种含36 个氨基酸的多肽，主要由中枢以及外周神经系统合成，其效应主要由G蛋白偶联受体家族介导。目前发现NPY系统主要有5种受体，分别为Y1，Y2，Y4，Y5和Y6[18]，各种受体的分布不相同，在与NPY的亲和力方面，Y2>Y1>Y5，Y4=Y6[18]。研究认为Y1和Y2在骨重建中起到较为重要的作用。Y1和Y2均大量表达于中枢神经系统，然而分布区域并不完全相同。在中枢神经系统，NPY在下丘脑弓状核表达最为丰富[18]。这些NPY能神经元主要表达高水平的Y2受体，并且投射到其他区域，例如富含Y1受体的室旁核[19]。近几年，NPY受体也被发现表达于外周，例如在成骨细胞以及骨细胞发现表达有Y1受体[20, 21]。研究发现NPY在小鼠下丘脑特异性过表达可显著降低成骨细胞成骨能力[22]，并且在皮质骨以及松质骨中矿化和未矿化的骨形成速率显著降低(7倍以上)。另外，NPY基因敲除小鼠的皮质骨横截面积与厚度显著增加，也与骨形成增加有关[22]。可以看出NPY在骨重建中起到重要的作用，该作用主要由Y2和Y1介导。

2.1 Y2受体在骨重建中的作用

2.1.1Y2受体对骨代谢的作用

Y2受体主要表达于中枢神经系统，包括海马和下丘脑的特定区域，在下丘脑的弓状核尤其丰富[23, 24]。研究证明基因敲除小鼠下丘脑Y2受体可促进骨形成，使松质骨以及密质骨的骨量增加[24,25]。Baldock等[24]的研究发现无论是Y2受体基因全部敲除还是条件性敲除下丘脑神经元Y2受体基因，都可以刺激成骨细胞活动增加，观察到松质骨的体积显著增加以及成骨细胞矿化沉积率(mineral apposition rate, MAR)显著增加，没有证据显示骨吸收指数以及破骨细胞数量的改变。另外Baldock等发现在骨组织中缺乏Y2 mRNA，提示Y2受体在骨组织中没有表达。Sainsbury等[26]研究发现Y2-/-; Y4-/-小鼠与Y2-/-小鼠比较，在松质骨体积以及成骨活动上呈现协同作用(3倍)，而密质骨的骨量显著下降。以上研究表明，Y2受体主要通过降低成骨细胞成骨作用来调节骨重建，对破骨细胞活动调节无明显效应。

Y2受体还被发现对骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)的活动起到重要作用。Lundberg等[21]体外去神经培养Y2-/-小鼠BMSCs，与对照组相比，Y2-/-小鼠存在时间依赖性的矿化作用增强，并且矿化模式更加均匀分布。成骨标志碱性磷酸酶以及骨钙蛋白也被发现显著增加。另外还发现间充质干细胞数量是对照组的2倍，在接种不成熟以及成熟间充质干细胞后发现Y2-/-组与对照组的集落形成能力未见明显差异，提示Y2-/-组的骨形成增强作用可能与间充质干细胞数量增多有关。

研究认为瘦素(leptin)与Y2受体在骨形成活动上有密切联系。瘦素作为一个脂肪因子，常被关注于其对脂肪代谢的作用。目前已证实其对骨形成活动的调节也有重要作用，与Y2受体不同的是，瘦素在松质骨以及密质骨上的骨代谢调节起相反作用，瘦素基因敲除可抑制密质骨形成，促进松质骨形成[25,27]。与Y2受体相同的是，瘦素受体也由下丘脑弓状核的NPY表达神经元表达，因此两者极有可能通过某些共同的通路起到骨代谢调节作用。Baldock等[25]对比了Y2-/-、ob/ob以及Y2-/-；ob/ob三组小鼠，发现ob/ob和Y2-/-；ob/ob二者的松质骨体积无明显差异，但是较Y2-/-组少。另外ob/ob以及Y2-/-；ob/ob的成骨细胞功能无明显差异，表明在无瘦素情况下Y2受体缺失并没有额外的成骨刺激效应，而当瘦素存在时，Y2受体缺失可使成骨细胞活动提高2倍，提示容许水平的瘦素可能可以激活Y2受体依赖的骨代谢通道。

2.1.2Y2受体调节血管生成的作用

脉管系统对于骨的生长以及骨重建有着至关重要的作用[28]。研究认为血管生成与骨形成是偶联的[29]。骨重建过程发生于一种特殊的血管化结构，称为骨重建单位[28](bone remodeling units, BRUs)。BRU可以促进成骨细胞与破骨细胞前体之间的相互作用，成骨细胞分泌的RANKL可以促进破骨细胞的分化与激活[30,31]。Song等[29]认为绝经后骨质疏松的骨髓中毛细血管和血窦数量减少以及骨灌注减少。因此血管生成在骨重建过程中有着重要的作用。

研究[32-34]发现NPY有刺激血管平滑肌生长以及促进血管上皮细胞的增殖以及迁移的作用。Ekstrand等[35]发现对角膜模型应用Y1受体激动剂后并未观察到血管生成的反应，而在Y2受体缺失的小鼠模型中，NPY无法诱导血管生成，提示Y2介导血管生成通路。另外Ekstrand等[35]发现在NPY以及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等细胞因子作用下的新生血管的血管内皮细胞都表达有Y2受体，而没有Y1受体，Y1受体仅表达于血管平滑肌细胞，而血管上皮细胞是唯一一种形成初级血管丛的细胞类型，因此Y2受体的作用可能为引导血管的生长，而当微血管生成，其他的细胞类型包括血管平滑肌细胞等在Y1受体的介导下被招募以重建新生血管。Alasvand等[36]在应用了Y2受体阻滞剂BIIE0246后发现可以减少肿瘤组织的毛细血管密度，提示Y2受体阻断可以抑制肿瘤血管形成。Ekstrand等[35]发现Y2受体基因敲除鼠的皮肤愈合较对照组慢，并且在外源性NPY的介入下，NPY可以促进对照组小鼠的皮肤愈合，却无法促进Y2受体基因敲除鼠的皮肤愈合。以上研究均表明了Y2受体在促进血管生成中起到重要的作用，这在骨重建过程可能起着重要的作用。

关于Y2受体激活刺激血管生成的机制目前尚未明确。VEGF是刺激血管生成的一种主要的细胞因子，Ekstrand等[35]发现 VEGF诱导的新生血管同样表达有高水平的Y2受体，并且Alasvand等[36]发现Y2受体抑制剂可以显著减少肥胖组小鼠的血清VEGF 浓度，以及抑制肿瘤血管形成，提示NPY与VEGF在血管生成方面可能有一定的联系。NO在VEGF刺激血管生成的过程中发挥关键的作用，Troke等[37]发现Y2受体能抑制腺苷酸环化酶，从而抑制ATP转换为cAMP。cAMP的减少影响了钙与钾离子通道，并且动员胞内钙离子，钙离子与钙调蛋白结合激活上皮细胞eNOS，促进NO的生成。Saraf等[38]认为NPY与Y2受体结合后促进NO的合成，NO反过来上调NPY以及VEGF等的表达，最终产生血管形成的效应。因此，VEGF与NO在Y2受体激活促进血管生成中起到了重要的作用。

2.2 Y1受体在骨重建中的作用

2.2.1Y1受体对成骨细胞的作用

研究[39, 40]发现鼠Y1全部敲除可以增加成骨细胞活动，引起松质骨与皮质骨体积增加。然而仅敲除下丘脑Y1受体时骨的表型并未发生改变，提示对骨代谢起调节作用的Y1受体并不存在于下丘脑。另外下丘脑Y1-/-、Y2-/-以及Y1-/-;Y2-/-双敲除三组比较，亦无明显差别，提示NPY对骨代谢的调节可能是通过Y1与Y2受体共同参与的一条通路，只是两者的分布的位置不同。Lundberg等[21]通过原位杂交显示在股骨内皮质和松质骨表面的成骨细胞表达Y1受体而没有Y2受体，进一步证实了以上观点。Lee等[41]认为下丘脑的NPY与Y2受体结合，通过交感神经元释放NPY并与成骨细胞的Y1受体结合，从而抑制骨形成。关于Y1与Y2在骨代谢方面作用的关系还需要更多研究来证实。

事实上，研究证明Y1受体表达于成骨细胞表面[20, 21]，Y2受体在骨组织中没有表达[24]，因此NPY系统可能通过局部表达的Y1受体来直接调节成骨细胞的合成代谢作用。近年已有研究表明成骨细胞表达的Y1受体在骨形成过程中起到成骨性的作用[20,23,42]。Lee等[42]通过基因敲除小鼠成骨细胞Y1受体，证实Y1-/-小鼠的股骨松质骨体积、骨小梁厚度以及骨小梁数量显著增加，说明其矿化沉积率以及骨形成率增高，反映成骨细胞活动的增强。Lee等通过特异性敲除幼稚[43]与成熟[42]骨细胞，发现松质骨与密质骨的骨量均明显增加。Baldock等[23]的研究与上述结论一致。综合以上，Y1受体可通过对成骨细胞活动的影响来调节骨重建，对骨重建起到重要作用。

Liu等[44]研究发现NPY可以呈浓度依赖性促进BMSCs的成骨细胞分化作用，并且可以上调β-catenin 以及p-GSK-3β的表达，该作用可以被Y1R抑制剂以及Wnt通路抑制剂抑制，提示NPY与Y1R激活可以促进BMSCs的成骨分化作用并且该作用与经典Wnt通路有关。然而Lee等[20]的研究提示Y1-/-小鼠有更强的间充质干细胞增殖以及成骨分化功能，提示Y1受体可直接抑制间充质干细胞向成骨细胞分化，并且在体外培养Y1敲除鼠的间充质干细胞表现矿化增强。有趣的是，上文提到Y2基因敲除鼠的间充质干细胞培养后表现出矿化增加以及骨祖细胞数量增加，Lundberg等[21]发现Y2基因敲除鼠成骨细胞的Y1受体表达明显下调，提示Y2信号通路的阻断介导了成骨细胞Y1受体表达下调。Lundberg等[21]认为由于Y2受体缺失导致NPY释放增多，过度刺激Y1受体从而导致Y1受体表达下调。以上研究结果说明Y1受体调节间充质干细胞向成骨细胞分化以及矿化作用。

2.2.2Y1受体对破骨细胞的作用

值得注意的是，Y1受体在巨噬细胞功能中起到重要作用，而破骨细胞与巨噬细胞同是来源于造血干细胞单核/巨噬细胞系，因此可以推测Y1受体也可能表达于破骨细胞并对骨吸收发挥调节作用。Baldock等[23]研究发现Y1基因全部敲除小鼠的破骨细胞数量以及表面积显著增加，而Lee等[42]仅敲除成骨细胞Y1受体后发现破骨细胞数量与表面积并未发生明显改变。事实上曾有研究[45,46]表示NPY可以通过影响鼠骨髓细胞环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)、核因子κ B受体活化因子配体(receptor activator for nuclear factor-κ B ligand，RANKL)以及骨保护素(osteoprotegerin，OPG)的产生来调节破骨细胞生成，因此有学者认为由于Y1受体缺失导致成骨细胞活性的改变可能会影响到破骨细胞的活性。然而Matic 等[47]和Lee等[42]的研究表示不管是Y1受体全部敲除还是成骨细胞特异性敲除，RANKL/OPG均没有明显改变，因此关于Y1受体在破骨细胞方面的作用目前存在较大的争议，还需要进一步研究。

3 展望

综上所述，骨微损伤的累积是造成骨质疏松骨折的一个重要原因，NPY通过Y1受体与Y2受体直接或间接地参与骨微损伤修复并且在这个过程中起到重要的作用，其具体机制目前尚未明确，因此NPY对骨质疏松骨折等疾病的诊断与治疗具有极为重要的潜在价值。进一步地研究NPY在骨重建过程中的机制对于骨质疏松骨折的早期防治具有重要的意义。