MicroRNA335对鼻咽癌细胞侵袭的调控作用

张松 袁佛良 吴淑献 熊武 余坤飞 康喜讯 姜军合

近来许多学者研究发现, 鼻咽癌的发生和转移与多种基因有关, 例如一些抑癌基因的失活及原癌基因的激活可能导致肿瘤发生及转移。MicroRNA-335是近来发现的一种MicroRNA, 最近研究发现它与多种肿瘤密切相关。Sun等［1］研究发现MicroRNA-335抑制结肠癌的侵袭和转移。Jiang等［2］认为MicroRNA-335的表达与神经胶质瘤差的预后有关。本研究探讨了MicroRNA-335表达对鼻咽癌细胞侵袭的调控作用, 具体报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料来源 本研究中CNE 2细胞为鼻咽部低分化癌培养建系而来, 在1640培养基, 含适量10%胎牛血清、37℃、二氧化碳培养箱中培养。在细胞融合80%左右时用胰蛋白酶消化后分离CNE 2细胞, 然后分成6等份, 分别接种在六孔板的孔中, 将6孔随机分为两组, 每组3孔。培养24 h后,一组用5-杂氮-2脱氧胞苷处置, 另一组不加任何药物作,24 h后更换培养基继续培养, 再过24 h加胰酶消化, 用于后续实验。

1.2 甲基化特异性聚合酶链法(MSP) 将上述两组细胞提取DNA, 进行亚硫酸氢盐修饰, 再用甲基化和非甲基化两组引物对修饰过的DNA分别扩增。甲基化引物序列(M)：F: TTTGTATTGTGATTTTATTTTACGT, R: AACAAATTTCC TTTACAA CAACG, 非甲基化引物(U)：F：TTTGTATTGTGA TTTTATTTTATGT, R: AAACAAATTTCCTTTA CAACAACAC［3］。分别取上述两组聚合酶链式反应(PCR)产物5 μl用1%琼脂糖凝胶电泳, 观察MicroRNA335基因甲基化情况。

1.3 反转录-聚合酶链反应(RT-PCR) 提取上述两组细胞的总RNA, 进行反转录形成DNA第一链(cDNA), 然后行常规PCR。MicroRNA335引物：TCAAGAGCAATAACGAAAAA TGT(F), GCTGTCAACGATACGC TACGT(R)；U6 引物: CTCGCTT CGGCAGCACA (F), AACGCTTCACGAATTTGCGT(R)。反应结束后取每组PCR产物5 μl用1.5%琼脂糖凝胶电泳, 观察MicroRNA335表达情况。

1.4 细胞侵袭实验(Transwell小室法) 将上述两组细胞分别消化制成105个/ml悬液, 离心后, 弃上清, 加入200 μl无血清培养基, 吹匀后放入Transwell小室中。将小室放入含10% 胎牛血清(FBS) 1640的培养基Transwell板中。在二氧化碳培养箱中培养24 h。取出小室, 磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗去培养基, 用结晶紫染色10 min, 自来水洗除干净表面的结晶紫,用棉签擦除干净上室中的细胞, 用倒置显微镜观察侵袭细胞数, 随机取10个视野记录每组细胞数, 分析5-杂氮-2-脱氧胞苷对细胞侵袭能力的影响。

1.5 统计学方法 采用SPSS18.0 统计软件进行数据分析,计量资料以均数±标准差(±s)表示, 采用t检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 甲基化特异性PCR结果 未经5-杂氮-2-脱氧胞苷处理的CNE 2细胞中MicroRNA335基因是甲基化的, 而经过5-杂氮-2脱氧胞苷处理的CNE 2细胞中MicroRNA335基因是非甲基化的。

2.2 RT-PCR结果 在未经5-杂氮-2脱氧胞苷处理的CNE 2细胞中MicroRNA335不表达, 而在经过5-杂氮-2脱氧胞苷处理的CNE 2细胞中MicroRNA335高表达。

2.3 细胞侵袭实验结果 5-杂氮-2脱氧胞苷处理前的CNE 2细胞侵袭数(14.32±2.36)明显多于5-杂氮-2脱氧胞苷处理后的CNE 2细胞侵袭数(7.80±1.24)(t=6.373, P＜0.01)。

3 讨论

MicroRNA-335是近来发现的一种MicroRNA, 它可与靶基因mRNA结合后导致其降解, 对基因进行转录后的调控,在细胞的分化、增殖、凋亡等过程中起重要作用。近来学者们发现MicroRNA-335与多种肿瘤密切相关。Shu等［4］发现MicroRNA-335抑制恶性星形细胞瘤的生长及侵袭。Li等［5］发现基因启动子区甲基化状态可调控MicroRNA-335表达。

DNA甲基化是表观遗传学的一种遗传方式, 表观遗传学是指基因的序列不发生变化, 而通过基因的修饰改变其表达状态, 常见的表观遗传学方式有DNA甲基化、组蛋白乙酰化、小干扰RNA等。近年来, DNA甲基化已经成为肿瘤研究的热点, 学者们已经通过改变多种抑癌基因的甲基化方式来改变其表达, 进而抑制肿瘤的发生发展。先前的研究已经发现,在喉癌和鼻咽癌中死亡相关蛋白激酶基因的失活与其基因启动子区高甲基化有关, 用5-杂氮-2-脱氧胞苷去甲基化后死亡相关蛋白激酶基因重新激活, 癌细胞生长增殖及侵袭能力被抑制［6-8］。本研究用5-杂氮-2脱氧胞苷处理鼻咽癌细胞CNE 2, 使因甲基化状态失活的MicroRNA-335基因去甲基化而重新表达, 而鼻咽癌细胞的侵袭能力明显减弱。

综上所述, 在鼻咽癌细胞中5-杂氮-2-脱氧胞苷可以使甲基化的MicroRNA-335基因去甲基化而重新表达, 说明MicroRNA-335的表达是受其基因启动子区甲基化状态调控的。基因去甲基化后MicroRNA-335重新表达的鼻咽癌细胞较未处理的细胞侵袭能力明显减弱, 说明MicroRNA-335表达对鼻咽癌细胞的侵袭有抑制作用。MicroRNA-335可能成为鼻咽癌治疗的新靶点。

［1］Sun Z, Zhang Z, Liu Z, et al.MicroRNA-335 inhibits invasion and metastasis of colorectal cancer by targeting ZEB2.Med Oncol, 2014,31(6):1-10.

［2］Jiang J, Sun X, Wang W, et al.Tumor microRNA-335 expression is associated with poor prognosis in human glioma.Medical Oncology,2012, 29(5):3472-3477.

［3］王鹤 , 刘志利 , 德伟, 等.microRNA-335对人非小细胞肺癌细胞迁移、侵袭及增殖能力的影响.南京医科大学学报(自然科学版), 2012(6):795-799.

［4］Shu M, Zhou Y , Zhu W , et al.MicroRNA 335 is required for differentiation of malignant glioma cells induced by activation of cAMP/protein kinase A pathway.Molecular Pharmacology, 2012,81(3):292.

［5］Li Z , Li D , Zhang G , et al.Methylation-associated silencing of MicroRNA-335 contributes tumor cell invasion and migration by interacting with RASA1 in gastric cancer.American Journal of Cancer Research, 2014, 4(6):648-662.

［6］刘付梅.MicroRNA--150调控鼻咽癌细胞增殖、凋亡及侵袭的研究.广东医学院 , 2014.

［7］张配.MicroRNA调控上皮—间质转化的机制及其对鼻咽癌细胞侵袭和迁移的影响.蚌埠医学院 , 2014.

［8］何威.生长因子诱导的鼻咽癌细胞上皮—间质转换过程中的mRNA-microRNA调控网络.中南大学 , 2012.