水通道蛋白4抗体的研究进展

李 娇 商秀丽

中国医科大学附属第一医院神经内科，辽宁 沈阳 110001

水通道蛋白(aquaporins，AQPs)是广泛存在于动植物及低等生物不同组织中的一种“水通道”[1]，主要功能是转运水分子通过细胞膜，也有部分水通道蛋白可以转运甘油，哺乳动物中水通道蛋白共有13种亚型(AQP0-AQP12)[2]。水通道蛋白4(aquaporin-4，AQP4)是于1994年由JUNG等[3]利用水通道蛋白家族的同源性克隆而分离出来，在中枢神经系统中广泛分布，介导脑组织中水分子的转运。2004年LENNON等[4]利用间接免疫荧光法证明了在视神经脊髓炎(neuromyelitis optica，NMO)患者血清中存在一种特异性的抗体-NMO-IgG，能与脑组织中病变的微血管、软脑膜、软脑膜下以及Virchow-Robin间隙(VRS)等部位特异性结合。随后的研究证明了该抗体的靶抗原即为AQP4，因此该抗体也被称为水通道蛋白4抗体(AQP4-IgG)[1]。AQP4-IgG对NMO诊断的高度特异性也使其成为一种独立的疾病，并于2015年正式提出了视神经脊髓炎谱系疾病(NMO spectrum disorders，NMOSD)这一概念[5]。近年来AQP4-IgG一直是研究领域的热点问题。研究提示，AQP4-IgG不仅参与NMOSD的发病，也在其他类型中枢神经系统脱髓鞘疾病的致病机制中发挥作用，如多发性硬化(multiple sclerosis，MS)及Balo同心圆硬化(Balo’s concentric sclerosis，BCS)[6]，但AQP4-IgG的致病机制及其与上述疾病的临床相关性尚未明确。本文就AQP4-IgG的致病机制、常用检测方法及其与中枢神经系统脱髓鞘疾病的关系加以综述。

1 AQP4的结构和功能

AQP4是位于细胞膜上的水通道蛋白，其单体由6个跨膜的螺旋结构组成，形成5个环形结构，其中环A、C和E位于胞外，环B、D以及羧基、氨基末端均位于细胞内，其中环B和E环含高度保守的天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸(NPA)重复串联序列，2个NPA环折返进入胞膜双分子层可以构成亲水通道[7]。AQP4在整个中枢神经系统(central nervous system，CNS)中星形胶质细胞上表达丰富，特别是在脑实质与脑室及蛛网膜下腔中脑脊液间的界面处，也表达于外周的肾、胃、呼吸道、腺体及骨骼肌等处的上皮细胞[2]。星型胶质细胞膜上的AQP4有2种亚型，即M1(32 kD)型和M23(30 kD)型，两者的细胞外结构域相同，但M1在胞内N端有多余的22个氨基酸序列[8]。M1和M23单体可以聚集形成AQP4四聚体，进而形成正交排列颗粒(orthogonal array of particle，OAP)[9]。OAP的大小和形状取决于M23与M1亚型的比值，比值越大形成的OAP体积越大，而不同大小OAP的分布和功能有明显的不同[10]。作为一种双向的水通道蛋白，AQP4在缺血或中毒造成的细胞毒性水肿中可以促进水肿的形成，但在血管源性和间质性水肿中可以清除过多脑积水[2]，而OAP的形成可以进一步增强局部区域(如血管周围)细胞膜水的渗透性[11]。此外，AQP4还可以作为黏附分子参与星型胶质细胞的迁移、胶质瘢痕形成、神经细胞兴奋以及突触可塑性[12]。同时AQP4介导的神经炎症可以影响星形胶质细胞膜水的渗透性，并引起继发的细胞肿胀和细胞因子释放[12]。

2 AQP4-IgG的致病机制

血清中的AQP4-IgG由多个单克隆抗体组成，具有不同的AQP4结合能力[10]。AQP4-IgG不能识别AQP4单体单一的线性序列，只有当AQP4聚集形成OAP时，才能被抗体识别[13]。两者的结合并不影响AQP4转运水的能力，而是后续的炎性反应造成致病的效应[14]。AQP4-IgG是IgG1类抗体[10]，与星形细胞足突表面的AQP4胞外段的构象表位结合后，可以激活补体、形成膜攻击复合物，进而损伤星形细胞[15]。活化的补体(如C3a和C5a)还具有化学趋化的作用，可促进巨噬细胞和嗜酸性粒细胞在损伤部位的聚集。这两种细胞可以通过补体或Ig / Fc受体介导补体或抗体依赖性细胞毒性[16]。另外，活化的巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞可以在局部产生细胞因子、蛋白酶或活性氧物质，非选择性破坏灰质和白质结构，造成组织的损伤[17]。病理学研究也证实了NMO患者的病灶中不仅有AQP4缺失，同时在血管周围也存在补体和免疫球蛋白的沉积[18]。此外，谷氨酸转运体2(EAAT2)和AQP4作为大分子复合物共同表达于星形胶质细胞膜上。AQP4-IgG与AQP4的结合不仅造成细胞膜上AQP4的内化，也造成EAAT2的丧失，破坏了谷氨酸的动态平衡，从而导致谷氨酸的蓄积而产生神经毒性[7]，特别是对谷氨酸浓度敏感的神经元和少突胶质细胞，因此也造成了继发的脱髓鞘病变[19]。

AQP4-IgG造成的病变多累及中枢神经系统，但该抗体不在外周富含AQP4组织致病的原因尚未阐明。研究发现，视神经、脊髓及其他脑组织中单位组织的总AQP4的表达要明显高于外周组织，并更多地聚集形成体积更大的OAP结构[20]，而这些大体积的OAP更容易被AQP4-IgG识别[14]。此外，中枢神经系统中的星形胶质细胞较外周组织缺乏补体调节蛋白(CD46、CD55、CD59)的表达，而这些补体调节剂可起到保护作用，使组织免受AQP4-IgG和补体介导的损伤[21]。此外，脑脊液中AQP4-IgG的来源尚不清楚。CHIHARA等[16]研究表明，外周血中CD19int、CD27high、CD38high、CD180-表型的B细胞亚群在疾病发作期可以产生AQP4-IgG，并通过视神经筛板前和脊髓根部及脑干极后区未完全发育的血脑障碍进入中枢神经系统[7]。但也有研究表明，外周血中产AQP4-IgG浆母细胞可以在疾病发作期迁移到中枢神经系统，产生致病的AQP4-IgG[22]。

3 AQP4-IgG的检测方法

3.1基于组织的间接免疫荧光技术基于组织的间接免疫荧光技术(indirect immunofluorescence，IIF)是检测AQP4-IgG最为原始和基础的检测手段。LENNON等[4]利用成年小鼠脑冰冻切片与稀释后的病人血清进行抗原抗体结合反应，再使用荧光素标记的抗IgG标记抗体，通过荧光显微镜检测AQP4-IgG的滴度。此方法检测AQP4-IgG的敏感度为73%，特异度可达91%[23]。该法因底物的简便易得和实验技术的相对简单而被广泛使用。虽然大鼠和人类AQP4的氨基酸序列是高度同源的，但两者细胞外环的氨基酸序列仍存在一些差异[24]，可能影响抗原抗体的识别过程。此外，IIF也能染色目标抗体外其他共存的抗体，使检验结果呈假阳性。为减少这种非特异性染色，血清必须进行显着稀释(1：60～1：120)，这可能导致在低效价样品检测时出现假阴性结果[25]。另外，该种方法是半定量分析，结果依赖于实验人员的观察，费时费力[26]。

3.2基于细胞测定法基于细胞测定法(cell based assay，CBA)是使用稳定表达人AQP4蛋白的细胞作为底物，再使用间接免疫荧光，特异性检测AQP4抗体，敏感度可达91%，敏感度可达100%，明显高于IIF法[27]。但该方法也存在一些缺点。首先，非稳定转染的细胞需要在测试之前重新转染；另外，转染细胞的AQP4表达水平可能随着时间的推移而下降[28]。基于细胞测定法操作相对较为简单，能批量进行半定量检测，是目前临床上最为广泛使用的检测手段。

3.3酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)是将纯化的AQP4蛋白吸附在固相载体表面，将血清样品中待测的抗体与之结合，形成固相抗原-抗体复合物，再用酶标抗Ig抗体(二抗)与固相免疫复合物中的抗体结合，形成固相抗原-抗体-酶标二抗复合物，测定加底物后的显色程度，确定待测抗体含量[29]。其灵敏度在NMO患者中可达72%，特异度可达98%。该技术具有定量优势，可以用来观察抗体浓度与疾病的严重情况[30]。

3.4放射免疫沉淀分析放射免疫沉淀分析(radio immunoprectation assay，RIPA)是于2007年由PAUL等[31]建立的定量检测AQP4-IgG的新方法。该方法使用真核翻译/转录系统克隆和表达人AQP4，用放射性35S蛋氨酸标记得到35S-蛋氨酸-AQP4。通过测定该复合物中的35S放射性强度，确定AQP4抗体的浓度。该检测方法敏感度为57%，特异度为98%。RIPA的优点是能同时测定大量的血清标本，并能定量分析结果，不受观察者影响，但该种方法因其敏感度偏低和过于高端的技术而未能在临床中广泛使用[28]。

3.5荧光免疫沉淀荧光免疫沉淀(fluorescence-based immunorecipitation assay，FIPA)是利用免疫沉淀原理建立的定量检测AQP4抗体的新方法，使用人胚胎肾细胞(HEK293)稳定表达AQP4，用绿色荧光蛋白标记AQP4得到EGEF-AQP4，之后再裂解细胞获得EGFP-AQP4提取物，将其与抗体结合，通过测定复合物中的绿色荧光蛋白荧光强度，确定AQP4抗体浓度。该方法检测的灵敏度可达76%～80%，特异度可达100%[32]。但该检测方法耗时费力，且所需的高端细胞培养设施，限制了该法在临床中的使用[28]。

4 AQP4-IgG与视神经脊髓炎谱系疾病

视神经脊髓炎(neuromyelitis optica，NMO)是一类中枢神经系统自身免疫性疾病，以单发或复发的视神经炎(optic neuritis，ON)和(或)长节段横贯性脊髓炎(longtudinally extensive transverse myelitis，LETM)为特点[33]。2004年NMO特异性抗体NMO-IgG的发现[4]使NMO成为一种独立的疾病，随后的研究即证明了该抗体的靶抗原即为水通道蛋白4(AQP4)[1]。AQP4-IgG对NMO诊断的高度特异性，也使其成为诊断标准之一。此外，临床上还有一组疾病，具有和NMO相似的发病机制及临床表现，如单发或复发性ON或LETM、可伴或不伴AQP4-IgG阳性，最终可演变为NMO[34]。因此。WINGERCHUK等[35]于2007年正式提出了视神经脊髓炎谱系疾病(NMOSD)这一概念。2015年NMO诊断国际专家组取消了NMO的个别定义，并达成了NMOSD诊断标准国际共识[36]。

以视神经炎起病的NMOSD患者多表现为单眼或双眼视力下降、眼痛及视野缺损。AQP4-IgG阳性的ON较抗体阴性的患者临床表现更重，更易复发[37]。AQP4-IgG累及的ON多造成双侧、长节段的视神经炎，病变部位多位于后视觉通路，包括视交叉、视束以及颅内段，而MS-ON更常累及单侧、短节段的视神经，病变多位于前视觉通路[38]。长节段横贯性脊髓炎(LETM)为病变延伸超过3个椎体节段的脊髓损伤，是NM0SD典型的表现之一[39]，约41.2%的LETM患者合并AQP4-IgG阳性[40]。以LETM起病的患者常表现为单侧或双侧肢体无力、感觉异常、尿便障碍，还有一些特殊症状，如皮肤游走性瘙痒和束带感[41]。合并AQP4-IgG阳性的患者更常以纯运动症状起病，而以纯感觉症状起病的患者多为抗体阴性[42]。AQP4-IgG累及的脊髓病变多位于颈部[43]，且抗体滴度越高，病变节段越长[24]，复发率也更高[44]。此外，合并AQP4-IgG阳性的NMOSD患者中，约14%的患者以短节段脊髓炎(STM)起病，其中92%的患者在之后的随访中发展为长节段脊髓炎[45]。由此可见，以STM起病的NMOSD患者并不罕见，而将其误诊为MS会影响其早期及后续的治疗及恢复。1999年NMO的诊断标准中，“发病时头颅MRI阴性”是诊断该病的支持标准之一[35]。但随着研究的进展，发现约60%的NMOSD患者可合并脑部病变，合并AQP4抗体阳性时该发生率为46.7%，而抗体阴性时该发生率可达76%[46]。NMOSD累及脑部病变的位置比较多变，临床表现也比较复杂。其典型的病变位于高AQP4表达区，如下丘脑和室管膜周围、第三、四脑室周围的间脑和脑干等处[47]，临床表现为顽固性呃逆和恶心、复视和延髓功能障碍、激素异常分泌综合征等症状[48]。

5 AQP4-IgG与其他类型的中枢神经系统脱髓鞘疾病

多发性硬化(MS)是由髓鞘自身反应性T细胞介导的中枢神经系统炎性脱髓鞘疾病。MS有两种不同的亚型：视神经脊髓型MS(OSMS)，病变主要累及视神经及脊髓，与NMO相似；经典的MS(CMS)[49]。在OSMS患者中，血清AQP4-IgG的阳性率可达20%～30%[50]，且多合并长节段脊髓病变[34]，于脱髓鞘病灶处也可见到AQP4的丢失[18]。因此部分学者认为，OSMS与NMO有同样的致病机制。CMS患者血清AQP4-IgG阳性率为5%～10%，但MS典型的颅内病变更多见于抗体阴性的患者[51]。

Balo同心圆硬化(BCS)是一种罕见的以病灶处髓鞘脱失区与髓鞘保留区呈特征性同心圆或洋葱皮样相间排列为特征的疾病，是多发性硬化症的罕见亚型[52]。GRABER等[53]报道了1例NMO患者合并脑干Balo同心环病变，病理学研究也表明BCS所有脱髓鞘病变区及髓鞘保留区存在广泛的AQP4丢失，且血管周围有大量淋巴细胞堆积，提示在BCS中也发生与AQP4相关的星形细胞病[54]。但在这些患者的血清中却未能检测到AQP4抗体，因此，BCS病变处AQP4的丢失可能并不依赖于AQP4-IgG的介导[55]。

6 展望

AQP4-IgG的发现距今已有十多年的历史，其为NMOSD的诊断、治疗和预后判断提供了一个新的方向，但其在NMOSD及其他中枢神经系统脱髓鞘病中的发病具体机制并未完全清楚，仍需要更多的实验研究来阐明AQP4-IgG确切的致病机制。另外，提高AQP4-IgG检验方法的灵敏度也是一个值得关注的问题，特别是在NMOSD病程早期，能及时做出准确的诊断，为患者提供最佳治疗时期，改善预后。