类激素小肽在花生胁迫应答中的应用与展望

徐 扬，成 波，丁 红，慈敦伟，秦斐斐，张智猛

(山东省花生研究所，山东 青岛 266100)

花生作为重要的油料和经济作物，在我国农业生产中具有举足轻重的地位[1]。花生具有抗旱、耐瘠、适应性强、中度耐盐碱等特点，是盐碱、干旱等地区较适宜种植的作物[2]，但恶劣环境仍会制约花生产量和质量的提高。因此，如何在逆境环境条件下实现花生产量的增长是亟需解决的问题。传统育种方法周期长、效率低、发展缓慢，而花生转基因研究成果相当匮乏。因此，探讨既可提高花生对环境胁迫的耐受能力，还可弥补传统育种长周期的研究途径具有重要意义。

植物作为固着生长的物种，不可避免地会暴露于诸如细菌、真菌、病毒、干旱、盐碱、高低温等各种生物和非生物胁迫环境下。植物通过复杂的信号途径来感知外界的环境变化，通过体内的信号交流，最终增强其自身的耐受性[3-4]，这个过程包括两种情况，叶片和根部之间的长距离信号传递和同一组织处/临近细胞之间的短距离信号传递。而这两种“交流”需要不同的、可移动的“信使分子”来完成，这种“信使分子”又可细分为激素和小肽。激素作为一种重要的生长调节因子，在植物的生长发育、环境应答等过程中扮演了不可替代的作用，研究证明，植物激素包括生长素、乙烯和细胞分裂素等均可作为长距离信号分子参与胁迫应答[5]。而关于小肽的研究则明显滞后于激素，1991年在番茄叶片中发现的由18个氨基酸组成的系统素可以作为可移动的信号分子在叶片之间传递“虫咬信号”，首次提出小肽是一种短距离运输的信号分子[6]，C-terminally encoded peptide(CEP)这种小肽被证明可由“氮饥饿”条件所诱导并运输到地上部，随后另外一种小肽CEPD1从地上部将这种信号传递到根部，并促进了根部NO3-转运蛋白的表达，至此，小肽被证明也可以参与长距离运输[7]。小肽是由多个氨基酸串联组成的一条多肽链，其长度暂时没有明确的界定值，又称寡肽，微肽或短肽[8]，目前鉴定到的最短的仅由5个氨基酸组成的Phytosulfokine(PSK)小肽[9]，较长的却有多达120个氨基酸组成的分泌型脂质结合多肽(cysteine-rich peptides，CRPs)等[10]。小肽和激素具有很高的相似性，因此，有学者将小肽定义为“一类未被定义的激素”。

近年来，高通量测序技术的发展与成熟，多种小肽被鉴定并被证明具有多种生物学功能，如可影响根茎分生组织发育、自交不亲和、花粉管生长、气孔形态维持和外源NO3-的吸收等多个过程[11-14]，其在胁迫应答信号传递中的作用愈加显著[15-20]，外源合成的小肽可显著提高植物对低温、干旱、病原菌等的耐受能力[21-22]。

花生作为重要的油料和经济作物，花生肽的研究主要集中在多肽制备，理化性质分析以及在食用和人类健康中的功能研究，其在环境胁迫中的应用鲜见报道[23-24]。本文系统概括了植物小肽在环境胁迫应答方面的最新研究成果，并对相关分子机制进行了总结，旨在为深入研究小肽在花生抗逆、抗病中的应用提供理论支持。

1 小肽在胁迫应答中的功能研究

目前关于小肽的功能研究主要集中于调控植物生长发育方面，在生物和非生物胁迫方面的功能研究报道相对较少，其在生物胁迫响应方面的功能研究主要集中在植物抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)方面。植物抗菌肽又称多肽抗生素，是一类水溶性好、热稳定性强、免疫原性低、广谱抗菌活性、半胱氨酸丰富的分泌型小肽，分子量通常在10 kDa以下[25]。目前报道的抗菌肽有150多种，根据其氨基酸的保守性和高级结构的不同可以分为硫素(thionins)、植物防御素(plant defensins)、打结素(knottins)、非特异性脂转运蛋白(non-specific lipid transfer proteins，nsLTPs)、凤仙花素(1bAMPs)、荠菜素(shepherdins)、蜕皮素(snakins)、橡胶素(heveins)和环肽(cyclotides)等九大类[26-27]。其抗菌机制有多种，例如植物防御素通过与真菌质膜高亲和位点结合形成离子通道，引起K+外流、Ca2+吸收、改变膜透性、实现对真菌的抑制[28]；受伤番茄叶片中发现的系统素(Hydroxyproline-rich glycopeptide，HypSys)是含有18～20个氨基酸的小肽，它是茉莉酸信号转导途径中的可移动的信号分子，可通过激活防御基因的表达参与植物抗虫免疫反应[29]；植物的激发子小肽(plant elicitor peptide，AtPep1)是拟南芥中首个报道的防御相关小肽，可通过促进防御基因plantdefensin1.2(PDF1.2)和病程相关蛋白(pathogen-related1，PR1)的表达提高植物的防卫能力[30]；Phytosulfokine(PSK)是含有五个氨基酸的硫磺肽(Tyr-Ile-Tyr-Thr-Gln)，不仅能够促进植物的生长和花粉管的发育[31]，还可作为免疫信号通路的负调控因子，依赖特异受体Phytosulfokine Receptor 1(PSKR1)弱化PAMP诱导的免疫反应(PAMP-triggered immunity，PTI)，防止过量免疫反应影响植物的正常生长发育[32]。

小肽除了在抗菌抗虫免疫反应中发挥作用外，在非生物胁迫应答过程中也具有不可替代的作用。胞外分泌型小肽家族CLAVATA3/embryo surrounding region(CLE)除了在根部发育方面具有重要功能外，该家族成员CLE9还可通过丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)级联途径调控气孔闭合，减少水分散失，从而增强拟南芥对干旱的耐受性[33]；水稻Small peptide drought tolerance 11(OsDTT11)编码了一个长度为88个氨基酸、半胱氨酸丰富的外分泌小肽，可依赖ABA参与干旱胁迫响应，过表达OsDTT11可提高水稻的干旱抗性[34]；过量表达Drought and salt stress response-1(OsDSSR1)提高了水稻的渗透调节物质脯氨酸和可溶性糖的含量，最终提高了水稻的耐旱性[35]；除此之外，拟南芥盐诱导的小肽cysteine-rich secretory proteins antigen 5 and pathogenesis-related 1 proteins derived peptide 1(AtCAPE1)通过抑制渗透调节和抗氧化途径中关键基因的表达，适度抑制盐胁迫应答反应，防止过度应答对植物生长造成负作用[36]。

2 小肽在胁迫应答中的应用

小肽发挥作用的分子机制是其实际应用的重要前提和理论基础。小肽在生物胁迫中的应用主要包括“小肽转基因方向”和“外源施加以达到增强植物抗病能力”两个方面。大量证据表明，抗菌肽对病原菌具有广谱抗性，如过量表达大麦硫素、胡萝卜防御素RsAFP2、大白菜防御素BSD1及大麦转脂蛋白的转基因烟草明显增强了对真菌或细菌的抗性；过量表达橡胶素类多肽抗生素Ah-AMP2，同样增强了烟草对青枯病和黑胫病的抗性[37-39]；转基因水稻表达的燕麦硫素基因(Asthil)显著增强了对荚壳假单孢菌(Pseudomonaspedunculata)的抗性[40]；Francois等在拟南芥中尝试同时表达胡萝卜防御素Rs-AFP2和大丽花防御素Dm-AMP1两种抗菌肽，结果显著提高了植物对黄色镰刀菌(Fusariumculmorum)等真菌的抗性[41]。

人工合成抗菌肽或利用微生物进行大量发酵生产，从而制备特殊的抗菌生物制剂是另一个重要的研究领域。目前有多种小肽已被人工合成并被证明具有明显的抗菌效果。Rs-AFP2是以萝卜防御素为基础合成的小肽，能够抑制多种真菌的生长[21]；D32R是檀梨属琉瑾的类似物，具有抑制致病性真菌(F.oxysporum,Plectosphaerellacucumerina，Botrytiscinerea)和致病性细菌(X.campestrispv.Translucens，C.michiganensis.)的功能[42]；RAF26是人工合成的抗真菌六肽，能够显著抑制Penicilliumitalicum，Penicilliumdigitatum，Botrytiscinerea等真菌的生长[43]。

植物小肽在非生物胁迫应答中的应用研究结果表明，AtPep3是一种可被盐诱导上调的小肽，体外合成并外施其C段的13个氨基酸(KPTPSSGKGGKHN)能明显抑制盐胁迫诱导的叶片失绿现象，增强植物对高盐的耐受性[22]；外源大豆多肽对于低温胁迫下香蕉幼苗体内可溶性蛋白的积累有显著的促进作用，并能降低幼苗细胞的膜脂过氧化程度，从而提高巴西蕉的耐冷能力[44]；喷施外源大豆多肽或聚天冬氨基酸可提高巴西蕉的抗高温和耐盐能力，保证巴西蕉在盐胁迫下维持较高的光合速率[45-46]。

3 花生多肽的研究进展

我国是花生生产大国，籽仁被大量用来生产食用油，其副产物—花生粕产量虽较高，但并未得到深加工利用。目前关于花生肽的研究主要集中于花生多肽制备、理化性质分析和功能研究。对花生粕适度水解会形成花生多肽，不仅可改善其物化性质，还可提高其吸收性和营养价值[47]。研究发现，花生肽具有显著的体外抑菌活性[48-49]，可通过抑制血管紧张素转化酶的活性来降低血压[50-51]，能够清除多种人体自由基，发挥抗氧化和延缓衰老的功能[52]。因此，寻找关键的功能小肽是花生蛋白深入研究的重点和热点。

4 花生小肽在胁迫应答中的应用前景与展望

目前关于小肽基因工程和其外源功能的研究多在水稻、拟南芥和烟草等植物中开展，虽然花生耐贫瘠耐干旱性较强，但花生对环境的依赖性依然较强，尤其在盐碱地的生长明显受到环境胁迫的影响和抑制，使花生产量和质量大幅降低。青枯病、叶斑病、白绢病、蛴螬和蚜虫等各种病虫害发生严重，也严重影响花生正常生长。因此，筛选既有抗菌能力又具抗逆能力的小肽，研究其对花生生长发育、抗菌、抗病等的促进作用具有重要意义。

在小肽—作物(花生)—抗病三者间的关系研究中，“优质抗菌肽”既可促进植物生长，还可提高花生抵抗各种细菌、真菌等生物胁迫能力，大幅减少农药的使用。抗逆小肽在提高植物抵抗各种不利生长条件的能力，降低盐碱胁迫对花生生长的抑制有重要意义。目前如何大幅度降低成本、批量生产并储存是小肽研究应用中急需攻克的关键因素和技术途径，采用微生物发酵和大批量工厂合成途径虽可行，但具体的工程优化尚需进一步探索。

通过生物信息学、转录组学和小肽组学等方法寻找花生“优质小肽”，是目前较为迫切的问题。目前花生的两个二倍体野生种和四倍体栽培种的基因组序列信息已经公布，利用生物信息学和转录组学为切入点，结合小肽尤其是外分泌小肽的特点，寻找功能小肽，进行具体的功能验证，以确定该小肽是“抗菌肽”还是“抗逆肽”。另外，小肽组学技术的成熟，也使得优质小肽的发掘工作变得简单、有效。从植物的木质部汁液中寻找可分泌及可被运输的分泌小肽也是较好的研究策略，但对于花生这种茎部较短的植物来说，要收集供小肽筛选所需5 kg左右的木质部汁液是一项较为艰巨的任务。

综上所述，小肽领域的研究在其他物种已有很大进展，尤其在动物研究领域，如用于靶向人类癌细胞的靶分子，其实就是一种多肽分子。基于花生基因组的测序时间较晚，相对于其他物种的研究明显滞后，但花生小肽的研究与深入，势必在花生抵御逆境胁迫研究领域发挥重要作用。