柑橘黄龙病菌与柑橘根系关系研究进展

雷梦英，杨贤智，黄少彬

（1.广东生态工程职业学院，广东 广州 510520；2. 广东省农业科学院农业经济与农村发展研究所/农业部华南都市农业重点实验室，广东 广州 510640）

柑橘黄龙病是一种毁灭性病害，可以侵染绝大多数的柑橘品种及其近缘属植物。1919年柑橘黄龙病在广东潮汕地区首次发现，近百年来已在世界近40个国家和地区的柑橘产区蔓延为害［1］。近年来，我国柑橘黄龙病呈现不断加剧和向北蔓延的趋势，已从原先的25°N以南扩展到 28～29°N 区域［2］。据监测，2017年我国新增柑橘黄龙病发生县（市）18个，共有11个省（直辖市）300多个县约16万hm2柑橘遭受到柑橘黄龙病的为害。其中，广东、广西、福建、江西等柑橘种植区较为严重。柑橘黄龙病导致广东省的贡柑和沙糖橘、福建省的永春芦柑、江西省的赣南脐橙等种植面积锐减，部分产业至今未能完全恢复。据调查统计，柑橘黄龙病在广东省为害最为严重，其发病面积约占全省柑橘种植总面积的25%以上，每年因柑橘黄龙病造成的损失约为50亿元［3］。

关于柑橘黄龙病的研究进展，国内外已有较多综述。Gottwald等［4］综述了柑橘黄龙病在美国和巴西的分布情况、病害流行规律以及对柑橘产量和品质的影响；范国成等［5］综述了我国1978—2009年期间有关柑橘黄龙病的研究概况，包括柑橘黄龙病的分布和为害、诊断与检测方法、传播途径和防控技术等；宋晓兵等［6］介绍了柑橘黄龙病菌分离培养的研究进展，阐述其分子检测鉴定技术，包括常规PCR、双重PCR、实时荧光定量PCR和环介导等温扩增（LAMP）快速检测技术；许美容等［7］介绍了柑橘黄龙病基因组学、转录组学、蛋白质组学、分子致病机理以及寄主分子抗病机理等方面的研究概况，并提出了未来的研究方向；Munir等［8］汇总并比较了热疗法以及抗生素、油菜素内酯、纳米乳剂等方法对柑橘黄龙病的防治效果。本文主要就柑橘黄龙病菌对柑橘根系营养和根系基因、蛋白表达的影响进行概述，并重点就柑橘黄龙病菌重建柑橘根系微生物群落、影响柑橘根系微生物功能基因表达等最新研究进展进行综述，旨在为系统开展柑橘黄龙病菌与柑橘根系互作关系的研究提供新的思路和参考。

1 柑橘黄龙病病原及其症状概况

1.1 柑橘黄龙病的病原菌

柑橘黄龙病的病原菌是一种韧皮部专性寄生的革兰氏阴性细菌，暂定为薄壁菌门α-变形菌纲（Proteobacteria）候选韧皮部杆菌属（Candidatus Liberibacter）细菌，分为3个小种：亚洲型（C. L. asiaticus）、非洲型（C. L.africanus）和美洲型（C. L. americanus）［9］。柑橘黄龙病主要通过带病接穗嫁接、带病苗木调运和带病木虱取食进行传播。最新研究发现，尽管根系交叉生长不能传播黄龙病，但根嫁接具备传播黄龙病菌的能力，发病率达36.7%［10］。迄今柑橘黄龙病病原菌尚不能人工培养，目前尚无针对该病的有效药剂和抗性品种，只能通过挖除病树、杀灭木虱、种植无病毒苗木和生态隔离等措施防控柑橘黄龙病的发生和蔓延。

1.2 柑橘黄龙病的田间症状

柑橘黄龙病是一种系统性病害，其症状在柑橘叶片、果实和根系上均有表现。柑橘感染柑橘黄龙病菌后，树势生长缓慢，一般3个月后显症［11］。叶片初期呈斑驳状，后期整体黄化、枯萎。果实变小、畸形，品质劣变，常表现为“红鼻子”果，丧失经济价值。新树感病后1～2年死亡，老树3～5年死亡［12-13］。感染黄龙病的柑橘叶片症状明显，并且柑橘木虱可以通过口针进入叶脉韧皮部取食传播柑橘黄龙病菌，因此普遍认为柑橘黄龙病菌优先定植于柑橘叶片，堵塞叶片韧皮部，导致柑橘根系碳水化合物供应不足，进而引发根系腐烂。

2 柑橘黄龙病菌侵染柑橘根系的研究

2.1 柑橘黄龙病菌侵染柑橘根系过程的研究

在柑橘黄龙病的研究中，柑橘黄龙病菌与柑橘根系的互作关系通常会被忽略。Tatineni等［14］利用常规PCR及荧光定量PCR检测发现柑橘黄龙病菌在感病植株的花、果实、叶片中脉、树皮和根系等组织中均有分布，并且根系中柑橘黄龙病菌的含量高于叶片中脉的含量。此外，Bassanezi等［15］在巴西圣保罗调查发现柑橘果实产量与柑橘黄龙病的严重程度遵从负指数模式，即甜橙感染柑橘黄龙病后虽然地上部分症状表现不明显，但其产量明显降低。该调查结果表明在柑橘地上部分表现出柑橘黄龙病典型症状前，有些未被发现的损害就已经发生。Graham等［16］在美国佛罗里达州田间实地调查发现，在哈母林甜橙和伏令夏橙叶片表现出斑驳状和荧光定量PCR检测出阳性结果前，其砧木Swingle枳柚（Poncirus trifoliata×Citrus paradisi）的根系干重已明显减少。Johnson等［17］利用荧光定量PCR检测和显微观察跟踪柑橘黄龙病菌在哈姆林甜橙中的移动情况，发现在地上部分显症前，柑橘黄龙病菌就已经在其根部大量扩繁。此外，柑橘黄龙病菌侵染根系和根系受损均发生在叶片、枝干韧皮部堵塞之前。基于上述研究结果，推断柑橘黄龙病菌在感病早期已通过韧皮部从柑橘木虱取食部位扩展至根系，并在根系中扩繁，从而使根系成为韧皮部传播柑橘黄龙病菌的库。当新的叶片长出后，柑橘黄龙病菌从根系迅速扩繁至幼叶中，导致地上部分显症。目前该推断有待于进一步实验验证。

2.2 柑橘黄龙病菌对柑橘根系生理功能的影响

柑橘生命周期长，根系在其生长发育过程中发挥了重要作用。柑橘根系的主要功能是将树体固定在土壤中，吸收水分和矿物质，储存营养物质。此外，柑橘根系还会分泌有机酸，使根际土壤中难溶性磷得以溶解，供自身吸收和利用［18］。Wu 等［19］发现印度酸橘幼苗嫁接带柑橘黄龙病菌的接穗5周后，根系干重降低了42%（2013年数据）和51%（2014年数据）。此外，感染柑橘黄龙病的印度酸橘幼苗须根中的淀粉和蔗糖含量均明显低于健康苗木。Kim等［20］在感染柑橘黄龙病的根系中观察到细胞壁增厚、淀粉积累，甚至细胞崩溃的现象。Etxeberria等［21］利用扫描电镜和透射电镜在感染柑橘黄龙病的甜橙根系中观察到淀粉缺失、韧皮部细胞塌陷和纤维消失等现象，而在其叶片、叶柄等部位均有大量淀粉积累，在茎干木质部也有淀粉分布。碳水化合物是植物防卫反应的能量库，柑橘黄龙病菌侵染柑橘导致根系部位的淀粉、蔗糖等碳水化合物代谢异常，根系活力下降，对柑橘疫霉菌等土传病害的侵染更加敏感，进而导致柑橘根系表皮脱落，根系腐烂［22］。上述研究表明柑橘黄龙病菌破坏了柑橘根系结构，引起根冠和根边缘细胞脱落，粘胶等根系分泌物减少，进而影响了柑橘根系对水分和营养物质的吸收，导致根系腐烂。

2.3 柑橘黄龙病菌改变了柑橘根系基因和蛋白的表达

近年来，国内外研究者采用芯片技术、转录组学、蛋白质组学等研究方法初步揭示了柑橘根系响应柑橘黄龙病菌侵染的分子机制。Aritua等［23］对感染柑橘黄龙病的瓦伦西亚甜橙根系进行了基因表达谱芯片分析，筛选出111个差异表达的基因，这些基因参与了碳水化合物代谢、生物胁迫和非生物胁迫应答、信号转导、蛋白质转运和降解、氧化还原反应等。Zhong等［24］采用转录组测序和iTRAQ技术分别分析了江西红橘感染柑橘黄龙病后根系的基因表达和蛋白表达情况，发现差异表达基因显著性富集的通路共19个。其中，蔗糖合成酶基因下调表达，而蔗糖转化酶基因上调表达，它们的差异表达可能与柑橘根系韧皮部堵塞、蔗糖供应不足有关；6个植物凝集素类似蛋白-筛管蛋白（phloem protein）显著上调表达，推测它们在筛板处沉积，堵塞维管束系统，参与植物防卫反应。已有研究发现柑橘感染黄龙病后，叶片中的筛管蛋白同样上调表达［25-26］；萜类、黄酮类、苯丙烷等次生代谢物合成相关基因在柑橘叶片中上调表达，参与了对黄龙病菌的防卫反应［27-29］，但这些基因在感染柑橘黄龙病的柑橘根系中却下调表达。此外，在蛋白质组水平上获得了与转录组关联性强的差异表达蛋白36个（27个上调和9个下调）。其中，病程相关蛋白枯草杆菌样蛋白酶基因上调表达3.14倍，其蛋白上调表达282倍，推测该蛋白可能通过保护根尖分生区参与柑橘根系抵御柑橘黄龙病菌过程。以上研究应用基因表达谱芯片、转录组学、蛋白质组学初步解析了柑橘根系响应柑橘黄龙病菌侵染的分子机理，为今后研究柑橘黄龙病菌侵染下的柑橘根系抗性机理提供了一些新的认识。

3 柑橘黄龙病菌对柑橘根系微生物的影响

根际微生物和根系内生菌是植物微生态系统的重要组成部分，与植物病害密切相关。这些微生物具有固氮、解磷、解钾等作用，为植物生长提供营养物质，或通过分泌生长素、细胞分裂素等植物激素调节植物生长发育。此外，它们也可以通过直接与植物病原菌竞争，或诱导寄主植物抗性，提高植物对病害的广谱抗性，保证植物健康成长［30-31］。近年来，根际微生物、根系内生菌与植物病害关系的研究已成为植物病理学研究的热点。

3.1 柑橘黄龙病菌改变了柑橘根际微生物的群落结构及其功能基因的表达

柑橘黄龙病菌显著改变了柑橘根际微生物的群落组成，同时柑橘根际微生物群落结构的改变及其功能基因表达丰度的变化是柑橘黄龙病菌在柑橘根系中扩繁的前提条件，并与其症状发展相关。柑橘根际微生物分属于8门45类83目137科183属，其数量明显高于柑橘叶际微生物的种类。网络分析发现柑橘根际微生物的群落组成及其多样性与柑橘黄龙病菌的相对丰度和发病程度相关（ANOSIM分析：R=0.592，P=0.001），柑橘黄龙病菌与伯克氏菌（Burkholderia）、微单孢菌（Micromonosporaceae）和黄单胞菌（Xanthomonadaceae）等根际微生物存在相互排斥的关系［32］。Trivedi等［33］通过构建柑橘根际微生物的16S rDNA基因克隆文库发现健康柑橘的根际微生物主要为伯克氏菌属（Burkholderia）、柄杆菌属（Caulobacter）、溶杆菌属（Lysobacter）、芽孢杆菌属（Bacillus）等植物促生菌，而感染黄龙病的柑橘则丧失了这些有益根际微生物。利用定量PCR技术进一步分析发现柑橘黄龙病菌不仅改变了柑橘根际微生物的种类，也改变了它们的相对丰度。Zhang等［34］采用宏基因组方法分析发现119种主要根际微生物中的50种在甜橙（砧木为Swingle枳柚）健康植株根系中的相对丰度显著高于感染柑橘黄龙病的植株根系中的相对丰度，而Inquilinus属、Aureimonas属以及柑橘黄龙病菌的伴生菌Thaumarchaea属在感染柑橘黄龙病植株根际中的相对丰度明显增多。涂祖新等［35］通过18S rDNA PCR高通量测序技术分析发现感染柑橘黄龙病的赣南脐橙根际真菌的群落丰度比健康株低48.8%，但群落多样性比健康株高23%，其中包括17个典型的黄龙病菌伴生真菌属，这些伴生真菌可能与柑橘黄龙病的发生密切相关，而支顶孢属是柑橘黄龙病菌最典型的伴减真菌。由于柑橘黄龙病菌导致根系腐烂，根际分泌物大量减少，从而导致以根际分泌物作为主要营养物质的伴减真菌数量显著减少。Trivedi等［36］利用GeoChip功能基因芯片分析了柑橘黄龙病菌对柑橘根际微生物功能基因多样性的影响，发现感染柑橘黄龙病的植株根际微生物参与固氮、氮循环、离子平衡等生命活动的功能基因的丰度明显少于健康植株。Wang等［37］通过元基因组和元转录组分析进一步证明了感染柑橘黄龙病后，参与植物养分利用以及涉及植物-微生物互作和微生物间相互作用的柑橘根际微生物功能基因的相对丰度和表达水平均明显下降。以上研究结果表明柑橘根际微生物群落与柑橘黄龙病菌存在明显的相互作用关系。由于柑橘黄龙病菌的入侵和增殖，柑橘根际微生物群落的动态平衡被破坏，进而影响了柑橘根际微生物群落的数量、种类和基因功能的表达。

3.2 柑橘黄龙病菌重建了柑橘根系内生细菌群落

部分种类的根际微生物可以进入植物根系的内部，通过定殖扩繁成为根系内生菌。根系内生菌可促进植物生长，调控其免疫系统，并与植物细胞、植物体内病原菌相互作用［38］。Blaustein 等［32］发现柑橘黄龙病菌明显改变了伏令夏橙、纽荷尔、尾张等五种柑橘品种根系内生菌的群落组成。感染柑橘黄龙病植株根系中土壤杆菌（Agrobacterium）、丛毛单孢菌（Comamonadaceae）、假单孢菌（Pseudomonas）的相对丰度较健康植株根系明显减少，而慢生根瘤菌（Bradyrhizobiaceae）、伯克氏菌（B u r k h o l d e r i a）、罗丹杆菌（Rhodanobacter）华杆菌（Sinobacteraceae）等的相对丰度显著增加。其中，慢生根瘤菌既是土壤细菌，也是根内生菌，具有固氮能力，与寄主植物具有良好的共生效应［39-40］，罗丹杆菌对植物病原菌具有生防效果［41］，而伯克氏菌则存在于寄主木质部中，诱导寄主防卫反应［42］。Trivedi等［43］从健康和感病的柑橘根系中分别分离得到的227种和125种不同形态的内生细菌，具有解磷、固氮、产铁载体、合成生长素、诱导寄主抗性等功能的植物益生菌在健康植株根系中的含量明显高于感染柑橘黄龙病植株根系中的含量。通过对柑橘根系内生菌与感染黄龙病叶片进行离体共培养，利用叠氮溴乙锭-荧光定量PCR（EMA-qPCR）筛选对柑橘黄龙病菌有拮抗作用的细菌，发现类芽孢杆菌（Paenibacillus validus）、赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus fusiformis）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）、微杆菌（Microbacterium oleivorans）、普城沙雷氏菌（Serratia plymuthica）等6株根系内生细菌对柑橘黄龙病菌具有明显的抑制效果。柑橘黄龙病菌入侵柑橘根系，重建了柑橘根系内生细菌的群落组成。柑橘黄龙病菌一方面竞争夺取了伴减菌的生存空间和营养，导致其种类和数量减少，另一方面通过与伴生菌相互作用建立动态平衡系统，实现在柑橘根系中的入侵和繁殖。因此，尽可能挖掘出柑橘黄龙病菌的伴生菌，建立柑橘黄龙病菌及其伴生菌的共培养体系，可以为解决柑橘黄龙病菌无法体外培养的技术难题提供新的思路。此外，部分内生菌可促进植物生长、诱导寄主抗性，通过分泌代谢物（如抗生素等）等方式抑制柑橘黄龙病菌的生长，但它们对柑橘黄龙病菌抑制作用的机理还需要更深入的研究。

4 研究展望

近年来，柑橘黄龙病的危害日益加剧，已成为柑橘产业发展的瓶颈。目前尚无防治柑橘黄龙病的特效药剂，只能通过种植无病苗木、砍除病树、扑杀柑橘木虱等措施进行防控。柑橘黄龙病菌侵染柑橘根系导致根系淀粉缺失、生物量降低，根系蔗糖代谢、抗病相关基因和蛋白表达异常。此外，柑橘黄龙病重建了柑橘根际微生物和根系内生细菌群落，影响了柑橘根际微生物功能基因的表达。因此柑橘黄龙病菌与柑橘根系互作关系的研究对探究柑橘黄龙病菌的致病机理具有重要的意义。关于柑橘黄龙病菌与柑橘根系互作关系的研究，以下几个方面仍需深入拓展：

（1）进一步阐述柑橘黄龙病菌的致病机理。Johnson等［17］认为感染柑橘黄龙病后柑橘根系受损，并不是由于地上部分韧皮部堵塞导致的根系碳水化合物缺乏，而是柑橘黄龙病菌对柑橘根系的直接破坏。柑橘黄龙病菌侵染柑橘根系，直接导致根系生物量减少，根系活力降低，并与土传病害相互作用导致对根系的进一步伤害［16］。为了进一步分析柑橘黄龙病菌与柑橘根系的互作关系，需从病原菌的角度，利用转录组、蛋白质组、代谢组等方法解析柑橘黄龙病菌侵染柑橘根系的机理，寻找其关键致病因子。

（2）柑橘黄龙病菌影响柑橘根际土壤微生物群落和功能基因表达的机理有待于进一步解析。目前的研究仅从根际营养供应的角度解释柑橘黄龙病菌对柑橘根际土壤微生物群落结构等方面的影响。感染黄龙病的柑橘根系营养供应不足，为根际微生物提供营养的根系分泌物减少［36］，导致柑橘根际土壤微生物和根系内生菌的群落组成、结构和数量发生了显著的改变。进一步导致涉及固氮、磷吸收、离子平衡和抗性等方面的根际土壤微生物功能基因的总体表达水平明显降低。而从柑橘黄龙病菌-柑橘根系-根际微生物三者的互作关系出发，可以系统阐述柑橘黄龙病菌影响柑橘根际土壤微生物群落、功能基因表达的机理。

（3）柑橘有益根际微生物和根系内生菌的发掘和利用。柑橘根际土壤微生物、根系内生菌与柑橘黄龙病菌密切相关，有益微生物对柑橘根系的生长发育起促进和保护作用，一些根系内生菌对柑橘黄龙病菌具有各种各样的抑制作用［43］。因此，进一步发掘和利用柑橘根际土壤微生物群体和根系内生菌，发挥有益微生物的根际效应，提高它们对柑橘黄龙病菌的拮抗效果，减少根系中黄龙病菌数量，从而减缓柑橘黄龙病的发生和流行。