重金属对鱼类细胞系遗传损伤和基因表达的影响

李状状，李 霞,2，王缙云，张晓雨，梁 艳

(1.大连海洋大学，辽宁省海洋生物资源恢复与生境修复重点实验室，辽宁 大连 116023;2.大连海洋大学，农业部北方海水增养殖重点实验室，辽宁 大连 116023)

细胞培养是指将有机体内的某一组织取出，使其分散成单个细胞，在人工条件下细胞存活、生长和分裂的技术。鱼类细胞培养始于二十世纪六十年代，由Wolf等[1]建立了世界上第一个鱼类细胞系——虹鳟(Oncorhynchusmykiss)性腺细胞系RTG-2,目前已报道的鱼类细胞系超过280株。这些细胞系被应用于病毒学、毒理学、生理学、肿瘤及基因工程等多个研究领域，近几年鱼类细胞系作为环境污染物的监测生物得到广泛的重视。

环境污染物是指进入环境后改变环境的正常组成和性质，进而直接或间接有害于人类与其他生物的物质。近些年，随着工农业生产快速发展，大量的污染物随废水及地表径流排放到水体中，使水资源环境遭受了一定的破坏[2]。进入水体中的主要是重金属(Cd、Cr、Zn等)、有机化合物(酚类化合物、有机农药、多环芳羟类等)、生物学性毒素(病菌、病毒等)等。其中重金属的影响尤其严重。

筛选检测水环境污染物的指示生物很重要。以往的工作主要是利用成体鱼作为检测指标，研究内容包括污染物对鱼体组织的损伤[3-5]、在鱼体内的富集和分布[6-7]及对鱼类生长发育的影响[8-9]等方面。随着鱼类细胞系的建立，利用细胞系研究污染物的毒性效应[10-11]、遗传学损伤[12-13]及对基因表达的影响[14-15]等方面的研究也有较多的报道。由于鱼类自身具有排毒和免疫作用，所以只有污染情况达到一定程度时一些不良生理指标才能表现出来，并且个体间也有差异，灵敏度也较差。体外培养的鱼类细胞可以直接和污染物接触，具有灵敏度高、均一性好、观察方便等特点，是毒理学研究理想的试验材料。笔者综述重金属对鱼类细胞系影响的研究进展，以期为环境监测及细胞毒理学研究提供帮助。

1 重金属对鱼类细胞系的影响

重金属可分为必需金属和非必需金属，约有45种。必需金属是机体进行正常生理活动所不可缺少的，如Cu、Fe、Se、Zn、Mg、Co等。重金属含量较低时，对有机体的生长发育有促进作用，但当浓度超过一定阈值时，就会对机体产生毒害作用[16]。非必需金属包括Cd、Hg、Ag、Pb、Au等，它们不参与机体的代谢反应，浓度较低时就可对机体产生毒性效应。我国水体中可检测的重金属有Cd、Cr、Zn、Cu、Pb、Ni、Hg、Fe等，其中危害程度较大的是Cd、Cr、Zn、Cu和Pb[17]。

1.1 重金属对细胞系的毒性研究

早在1968年Rachlin等[18]首次利用体外培养的胖头鲤(Pimephalespromelas)肌肉细胞系检测环境中Zn的毒性作用，得出细胞存活率与锌离子浓度之间呈正相关毒性效应。以后利用鱼类细胞系进行重金属的毒性效应及毒理学研究工作广泛开展起来。Babich等[19]研究了几种重金属对BF-2细胞系的毒性作用，结果显示重金属毒性大小为Ag>Hg>Cd>Zn>Cu>Co>Ni>Mn>Sn>Pb>Cr(三价)。Maraeine等[20]研究了6种重金属对虹鳟RTG-2细胞系的毒性效应，得出重金属毒性大小为Hg>Cd>Zn>Cu>Pb>Ni。Tan等[21]研究了4种重金属对草鱼(Ctenopharyngodonidellus)鳍条细胞系、草鱼肾细胞系、鲤鱼(Cyprinuscarpio)上皮瘤细胞系、斑点叉尾鮰(Ietaluruspunetaus)卵巢细胞系，褐色大头鱼(Brownbullhead)肌肉细胞系和胖头鲤肌肉细胞系6种鱼类细胞系的毒性作用，结果表明6种细胞系对4种重金属的敏感性大小为Cr和Cd>Zn>Cu，Cu对草鱼肾细胞系比其他细胞系毒性更强，而Cr和Zn对鲤鱼上皮瘤细胞系比其他细胞系毒性更强，Cd是对胖头鲤肌肉细胞系毒性最强的重金属，4种重金属对草鱼鳍条细胞系、胖头鲤肌肉细胞系均表现为中度毒性，Cu对褐色大头鱼细胞系毒性最低，其余重金属均表现为中度毒性，认为草鱼肾细胞系、胖头鲤肌肉细胞系、鲤鱼上皮瘤细胞系可作为重金属毒性应急评估较为敏感的生物检测指标。以上研究可以看出，Hg和Cd两种重金属在已研究的细胞系中表现为强毒性，Zn和Cu两种重金属对大多数细胞系表现为中度毒性，而其他重金属对不同细胞系或同一种鱼不同组织的细胞系则表现出强弱不同的毒性效应。分析认为，Hg和Cd作为有毒的重金属，其能够竞争性的替换Ca2+、Fe2+、Zn2+等金属离子在膜转运蛋白上的结合位置，通过改变Ca2+等其他离子通道大量进入细胞，进而造成细胞毒性[22]。

吴迪等[23]研究发现二倍体泥鳅(Misgurnusanguillicaudatus)鳍细胞系对重铬酸钾的敏感性高于三倍体泥鳅鳍细胞系。谭凤霞等[10]研究Zn2+、Cd2+、Cu2+和Cr6+4种重金属对稀有鮈鲫(Gobiocyprisrarus)鳍细胞系的毒性作用时发现，4种重金属对稀有鮈鲫鳍条细胞系的毒性效应均随着传代代数的增大而下降。以上研究结果说明细胞类型以及传代次数对重金属的吸收能力有一定的影响，这可能与细胞内金属硫蛋白基因的分类与分布不同相关，从而引起细胞对重金属的隔离与解毒能力的差异[24]。

不同重金属形态(是指重金属的价态、结合态、化合态和结构态4个方面，即重金属元素在环境中以某种离子或分子存在的实际形式)对细胞系毒性效应不同[25-26]。Babich等[19]研究了18种金属盐对BF-2细胞系的毒性作用，结果显示阴离子配合物毒性为亚砷酸盐>重铬酸盐>铬酸盐>砷酸盐>亚硒酸盐>高锰酸盐>硒酸盐。Goswami等[11]研究了Zn和Cd不同二价盐对印度鲤科鱼类Labeorohita鳍细胞系中的毒性，发现毒性排序为CdCl2

纳米级新型材料在工业生产与科学研究中被广泛应用，是生物学(化妆品、牙膏等)、医学(药品)和物理学(光学，通信工程等)应用必不可少的纳米材料。由于其化学成分和纳米尺度特征，研究其潜在毒性对生物系统的影响具有重要意义。Fernández等[27]研究评估新型材料氧化锌纳米颗粒、ZnO和Zn2+对鱼类细胞株(RTG-2，RTH-149和RTL-W1)的细胞毒性潜力，指出氧化锌纳米颗粒的毒性显著高于整体ZnO和Zn2+。Munari等[28]研究了用甲基聚乙二醇(M-PEG)包被的CdS量子点和硫化银对RTG-2细胞系的细胞毒性，并发现CdS量子点在高质量浓度(10 μg/mL和50 μg/mL)表现出高度细胞毒性，而Ag2S不显示细胞毒性效应。已有研究发现，这些新型纳米材料既可使原有重金属的毒性增强(ZnO-NPs)，也可使有毒重金属变为无毒重金属(Ag2S)，纳米颗粒的毒性来自它们具有更大的反应性和潜在增加细胞摄取重金属的能力[29-30]。因此研究重金属生产的新型材料对解决水环境污染问题、更新和补充重金属的排放标准有着非常大的作用。

1.2 重金属对鱼类遗传学损伤性的研究

遗传学损伤是指体内如DNA、RNA等遗传物质和相关的物质载体等受内外因素影响，导致遗传物质或者载体等发生损伤(如断裂、缺失等)，引起的系列遗传的生理病理改变的现象。细胞凋亡率、单细胞电泳形成的彗星拖尾率等以及微核率是常用的检测DNA损伤的指标，是评价环境中有毒物质对细胞造成遗传损伤的一项非常有意义的参数[31]。细胞凋亡是由基因控制的细胞自主的有序的死亡，它在多细胞生物清除异常细胞、调节细胞免疫反应等方面起着至关重要的作用[32]，而重金属能够诱导细胞凋亡，且凋亡率与重金属含量呈正相关。项黎新等[33]用Cd2+、Cr6+、Hg2+、Cu2+、As5+和Pb2+等重金属离子进行胁迫诱导草鱼ZC7901细胞，经末端脱氧核糖核酸转移酶介导的dUTP切口末端标记法检测后发现6种重金属均能诱导细胞发生凋亡。Wang等[34]采用DNA断裂分析和流式细胞技术研究发现亚砷酸钠能够通过氧化应激诱导野生细鳞鯻(Theraponjarbua)鳍细胞系(JF细胞)产生细胞凋亡。Krumschnabel等[12]应用SUB-G1法[30]测定镉和铜引起虹鳟鳃和肝细胞系细胞凋亡。Morcillo等[35]研究重金属Cd、Hg、MeHg(甲基汞)、As和Pb对金头鲷(Sparusaurata)SAF-1细胞系的遗传毒性，结果表明凋亡细胞数目随着重金属浓度的增加而增加。

彗星试验是一种在单细胞水平上通过测定细胞的拖尾率和迁移长度来检测DNA微损伤的方法。白丽雯等[36]采用该方法研究CuSO4对松江鲈(Trachidermusfasciatus)肾细胞系的DNA损伤作用，发现CuSO4可以导致松江鲈肾细胞发生拖尾和迁移，且拖尾率和迁移长度在半致死质量浓度时与对照组存在差异显著(P<0.05)。笔者利用该方法研究了氯化锌和硫酸铜分别对不同倍性泥鳅鳍细胞系的DNA损伤程度，结果发现随着重金属含量的逐渐增大，细胞的拖尾率和迁移长度均逐渐增大，在高含量时与对照组存在极差异显著(P<0.01)。

检测重金属对细胞系DNA损伤的另外一个指标是微核率[37]。重金属污染可使细胞有丝分裂产生异常形成微核，微核是有丝分裂后期无着丝粒的染色体片段或染色体单体滞留在细胞质中形成的，一般呈圆形或椭圆形。在污染物胁迫下，成体鱼红细胞微核率变化已成为重要的检测指标，但在鱼类细胞系鲜有报道。吴迪等[23]的研究发现不同倍性泥鳅(Misgurnusanguillicaudatus)鳍细胞系的微核率随着重铬酸钾含量的增大，二倍体和三倍体泥鳅鳍细胞系的微核率均先升高后下降，且三倍体细胞系微核率高于二倍体细胞系。认为微核率出现下降的原因是Cr6+含量过高时，抑制细胞的正常分裂或使细胞核完全裂解，造成微核率降低。但也有报道认为微核率与重金属浓度呈正相关的关系。白丽雯等[36]研究发现随着CuSO4含量的增大松江鲈肾细胞系的微核率逐渐增大，最高达14.33‰。由此可见微核率可作为重金属的检测指标。

1.3 重金属对鱼类细胞系基因表达的影响

在细胞内与重金属结合的主要是金属硫蛋白。金属硫蛋白是一种低分子量富含半胱氨酸的具有必需金属和非必需金属离子解毒的金属结合蛋白[28]。重金属离子诱导的金属硫蛋白基因的表达，已被证明在隔离和解毒各种重金属离子中发挥重要的作用[37]。金属硫蛋白的一个显著特点就是在转录水平上能够被环境中的重金属所诱导。当外界重金属元素含量达到一定值时诱导MT表达，且MT表达水平的高低与重金属含量直接相关。Chan等[38]研究Cu2+、Hg2+、Cd2+、Zn2+4种重金属对斑马鱼(Daniorerio)肝细胞系ZFL金属硫蛋白基因表达量时，得出Cd2+是对体外细胞系金属硫蛋白基因的表达最有力的诱导剂。Minghetti等[13]应用微列阵技术研究3种重金属(Cu、Zn和Cd)对金头鲷细胞系SAF-1金属硫蛋白基因的表达影响，研究得知，Cu、Zn和Cd均能增加金属硫蛋白基因的表达量。吴迪等[39]利用实时定量PCR技术研究发现重铬酸钾可诱导二倍体泥鳅鳍细胞系(DIMF)金属硫蛋白基因表达量显著升高。Cheuk等[40]运用RT-PCR方法研究了不同重金属(Zn2+、Cd2+、Cu2+、Hg+、As3+、As5+、Cr3+和Cr6+)对斑马鱼肝细胞系ZFL和斑马鱼尾鳍细胞系SJD金属硫蛋白基因金属调节元件结合转录因子1(MTF-1)mRNA诱导表达情况，结果表明每种金属离子均可诱导SJD细胞系MTF-1 mRNA水平的表达，并且发现Zn2+和Cd2+在两个细胞系均为最强诱导剂。这与Chan等[38]研究的结果一致。

也有报道，某些重金属离子选择性的增加某些细胞系内金属硫蛋白基因的表达。Cheuk等[40]运用RT-PCR方法研究了不同重金属(Zn2+、Cd2+、Cu2+、Hg+、As3+、As5+、Cr3+和Cr6+)对斑马鱼ZFL细胞系(肝)金属硫蛋白基因金属调节元件结合转录因子1(MTF-1)mRNA诱导表达情况，发现只有Zn2+，Cd2+，Cu2+，Hg2+和As3+可引起ZFL细胞MTF-1 mRNA水平的表达。Yan等[14]用DNA步移法和瞬时表达分析对几种重金属对斑马鱼尾鳍细胞系(SJD.1)MT基因启动子的调控作用进行了研究，发现Cu2+、Cd2+、Zn2+对SJD.1细胞系MT基因转录有明显感应，而Hg2+、Ni2+、Pb2+和Co2+无明显感应。

重金属诱导MT基因的表达还受其它因素的影响。Vergani等[41]研究细胞信号生长因子(GH)与重金属之间的干扰作用时，发现所有重金属诱导的MT-A(金属硫蛋白异构体)表达水平均高于MT-B(金属硫蛋白异构体)，但当重金属结合GH时有差异，对于MT-B Zn2+/GH和Cd2+/GH没有干扰，Hg2+/GH具有负面干扰；对于MT-A，Zn2+/GH和Hg2+/GH没有干扰，Cu2+/GH具有负面干扰和Cd2+/GH具有正面干扰。Magda等[42]研究发现鱼类细胞内的谷胱甘肽可以螯合重金属离子减少对细胞的毒性作用。

重金属不仅影响与其结合的特异性基因表达，也对其他基因如热应激蛋白、转运蛋白基因、特殊酶基因等表达产生影响。Deane等[43]利用RT-PCR技术研究重金属(Cd2+，Cu2+和Ni2+)诱导黑鲷成纤维细胞系热休克同源蛋白HSC70和热休克蛋白HSP70转录表达水平发现诱导HSP70对环境中重金属污染物有强响应。Minghetti等[13]应用微列阵技术研究3种重金属(Cu、Zn和Cd)对金头鲷细胞系SAF-1铜转运ATP酶(ATP7A)基因的表达影响，发现只有Cu可以增加ATP7A mRNA基因的表达水平，且其表达受MT基因的转录水平的调控。Torre等[15]利用实时荧光定量PCR测定CdCl2、HgCl2、As2O3和K2Cr2O7对鱼类PLHC-1细胞系ABC转运蛋白基因表达量的影响时发现，不同的重金属与特定的ABC转运蛋白基因特异性相互作用，调控发生在转录和功能水平。可见重金属对应激蛋白和转运蛋白基因的表达影响比较大，并且ATP7A转运蛋白基因的表达受金属硫蛋白基因转录水平的调控。重金属可以调节鱼类的许多细胞反应途径，并刺激多种基因的表达，因此，鱼类细胞系在探究水体中重金属对鱼体组织的影响机理起着重要的作用。

2 展 望

相对于活体鱼而言，鱼类细胞系对水体中的重金属反应更为敏感、快速。将鱼类细胞系作为水环境中重金属检测以及毒性应急评估的生物指标，对于建立科学的重金属排放标准、防治环境污染、保障养殖生产以及人类健康有着非常重要的意义。传统的研究是在试验条件下进行细胞的培养并进行环境污染物的毒理学研究，细胞生长环境与实际水环境还是有一定不同。Schnell等[44]设计了一种体外鱼鳃培养系统[42-44]，则解决了上述问题。建立鱼类细胞直接和待测试水环境接触的快速检测体系，是未来研究的重点。

环境中重金属种类众多，重金属是怎样调控凋亡基因表达的？转运蛋白如何诱导细胞摄取较多的重金属的？仍有许多重金属对细胞的作用机理等需要进一步深入研究。

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