观赏植物抗蚜虫新途径分析

杨振立，李 旸，吴志明，蒋楚燕，董文琦*

（1.河北省农林科学院，河北 石家庄 050031；2.中国农业大学，北京 100193）

蚜虫是繁殖最快的昆虫，在地球上为害作物广泛，还是植物病原体的传播介体（占已知传播病毒昆虫种类的45.8%[1]），其分泌物是人类呼吸道主要的过敏源，严重破坏城乡生活环境。蚜虫较难防治，主要原因在于其防御机制：有的种类能够分泌植物激素，使植物形成瘿瘤巢；有的分泌一层蜡质覆盖于体表，令药物难以渗入；有的释放强烈的芥末油气味，吓跑天敌[2]。

园林景观和城乡绿地是人群较为集中的地方，当前在防治蚜虫过程中常使用化学药剂喷雾法[3]。而化学喷雾法虽然见效快，但副作用明显，尤其是污染环境后对人和动物身体健康都有不利影响。对于非食用的观赏植物，我们可以选择转基因的抗蚜途径。相关研究主要集中在抗蚜基因、抗蚜资源和抗蚜生物药剂等方面。

1 植物抗蚜的研究现状

1.1 抗蚜基因克隆

抗蚜资源多存在于野生种或近源种中[4]。国外研究显示，在3 500个大豆种质中仅筛选到11个抗源[5]，在1 200个莴苣种质中筛选到2个抗源[6]，在4万个小麦资源中仅300个表现抗性[7]。植物对昆虫的抗性一般可分为驱避性、抗生性和耐害性3种类型，其中抗生性作用最明显，又包括多基因控制和单显（隐）基因控制，如小麦对麦双尾蚜（Diuraphis noxia Mordvilko） 的抗性、大豆对大豆蚜（Aphis glycines Matsumura） 的抗性是单显基因控制[8]；但在小麦和大麦中也发现了用于对付豌豆蚜（Acythosiphon pisum Harris）、玉米蚜 （Rhopalosiphum maidis Fitch） 的隐性抗蚜基因，数量性状控制的抗性更多[9]。理论上只有单显基因控制的抗性才有利于通过基因克隆和转化应用于其他物种上，而更多的资源适用于本作物的远源杂交或常规育种。随着植物基因组学和功能基因组学的发展，分离克隆抗蚜基因的能力日益增强[10]，一些抗蚜基因被克隆出来，如Mi-1可抗大戟长管蚜（Macrosiphum euphorbiae）[11]、Vat可抗甜瓜棉蚜（Aphis gossypii Glover）[12]，这类抗蚜基因一般与植物超敏反应有关，即对应植物能识别被蚜虫入侵的信号，以合成酚类物质、在细胞壁上沉积胼胝质或木质素等方式对抗蚜虫。目前虽然已有抗蚜基因被克隆，但是蚜虫种类很多，而一种基因可抗的蚜虫种类过少，因此，远远不能满足园艺上生物防治的需要。

1.2 高抗蚜资源挖掘

掌叶半夏是一种天然高抗蚜、无特殊味道的中草药，从20世纪90年代起人们尝试分离半夏的抗虫活性物质，初步研究后认为主要作用是由植物凝集素形成的，河北省农林科学院研究团队从中克隆出了PPA-1、PTA-1等多个基因[13]。凝集素的抗虫活性依赖与糖结合，而糖链很难利用转基因的方式进行正确表达[14]。2010年范汉东等[15]从半夏块茎总蛋白中发现了新的抗蚜活性物质，该物质属于植物胰蛋白酶抑制剂（Pinellia peatisecta trypsin inhibitor，以下称PPTI蛋白或PPTI基因） 类型，浓度达到0.5%时5 d后蚜虫的校正死亡率达到100%。更为重要的是经SDSPAGE、反相高效液相色谱测算该物质为不含糖的纯蛋白，质谱分析显示其相对分子量为20 596.09。PPTI蛋白与其它种类抗虫活性蛋白相比具有以下3个优点[16，17]：（1） 其是纯蛋白质作用的结果，相较于依赖与糖结合的凝聚素家族，基因更容易构建转化载体，应用植物范围广；（2）蛋白酶抑制剂一般具有更广谱的抗虫性，因此推测PPTI蛋白对多种蚜虫会有抗性；（3）昆虫不易产生对蛋白抑制剂的耐受性。人们进一步研究发现，在掌叶半夏叶片部位可由机械损伤和病虫侵入诱导高浓度表达此类蛋白。

1.3 蛋白酶抑制剂研究

前人对此已有很多研究，如达克东等[18]和周瑞苏等[19]系统研究了用豇豆CpTI转化苹果，60个转化株系中有2个对棉铃虫的抗性达到了100%；Yuan Ma等[20]研究了虫害诱导杨树胰蛋白酶KTI基因过量表达情况，明确了杨树KTI基因家族的功能多样性及其抗病抗虫作用。徐平丽等[21]从小麦中克隆到一个BBI型蛋白酶抑制剂TaUES基因，并证明其参与了盐和干旱胁迫应答。目前在植物中已经发现有三大类蛋白酶抑制剂——丝氨酸蛋白酶抑制剂、琉基蛋白酶抑制剂和金属蛋白酶抑制剂，PPTI蛋白属于第一类。丝氨酸蛋白酶抑制剂也已至少发现有6个家族，但只有部分成员具有较强抗性功能，除了以上几个以外，还有弧豆、马铃薯的蛋白酶抑制剂等，但已发现的蛋白酶抑制剂对抗逆境种类和作用效果千差万别。现有毒性的蛋白酶抑制剂基因搭配组成型启动子的转基因植物，其蛋白酶抑制剂表达量仍然较低，一般达不到蚜虫的致死剂量。

综上所述，从国内外抗蚜基础研究现状来看，存在以下4个问题：（1）植物对蚜虫的抗性机制很复杂，可用的单显抗生性基因很少；（2） 蚜虫种类很多，现有基因抗蚜种类过于单一；（3） 广谱的植物凝集素因大多含有糖链，而用基因工程的方法很难表达正确的糖链；（4）现有毒性的蛋白酶抑制剂基因搭配组成型启动子的转基因植物，一般达不到致死剂量。目前，真正有效的无公害防治蚜虫机制还未建成。

2 植物抗蚜的发展趋势

植物在遭受到昆虫取食时，就会产生防御反应，合成对攻击者有毒的防御物质，这是生物害虫无公害防治的基本原理[22，23]，也是抗蚜研究的主要趋势。掌叶半夏本身没有特殊气味，却一直都保持很强的对各类蚜虫的抗性，是掌叶半夏PPTI具有更强的抗性，还是有更多的物质参与其中？目前，蛋白酶抑制剂基因抑制昆虫生长发育的机制尚未达成共识[22，24]，但大多数研究者认为抑制机制主要表现在2个方面。一方面，蛋白酶抑制剂被摄入昆虫体内后与昆虫肠道内蛋白酶的活性部位或变构部位结合，使昆虫肠道内蛋白酶失去原有活性，昆虫不能得到足够的营养。赵飞等[25]研究了9种丝氨酸蛋白酶抑制剂的三维结构，从活性区拉式角（二面角）取向与对应物二面角取向的角度演示了二者相互作用的机制，提出为抑制剂分类的“标准机制”。但对于造成不同植物胰蛋白酶抑制剂间抗虫性能差异的原因，我们知之不多。另一方面，蛋白酶抑制剂刺激昆虫过量分泌消化酶，通过神经反馈，使昆虫产生厌食反应，昆虫不能摄取足够的营养。对此方面研究能够支撑的实证更少，很有必要进一步研究明确或补充其机理，用于提高蛋白酶抑制剂的抗蚜效果、指导观赏植物的治蚜实践。因此，研究掌叶半夏PPTI在观赏植物上的抗蚜功能、完善其抗蚜机制成为该趋势的关键所在。

3 PPTI的应用分析

3.1 观赏植物选择

月季（Rosa Chinenses） 是观赏植物的代表，为全球重要的观赏植物之一，被广泛应用于城乡绿化。在我国包括北京、天津和石家庄等在内的近50个城市将月季定为“市花”，而月季在生长季节中遭受蚜虫为害很严重，虽然月季的组织培养和再生系统较为成熟[26]，但是其抗蚜虫基因转化尚未见报道。可以看出，PPTI率先在月季上应用的条件已经具备。从克隆掌叶半夏高性能基因开始，探究其抗蚜机理，进行体内、外抗蚜虫功能分析和转化应用途径研究，就可以用基因改造的方法解决蚜虫在观赏植物上较难防治的问题。

3.2 重点研究内容

开展PPTI相关的功能及其抗性机制研究，利用PPTI蛋白进行酵母表达和抗虫范围测定，将PPTI与绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP） 进行融合表达，进行蚜虫肠道内定位和功能分析，同时采用酵母双杂交技术筛选出与PPTI互作的所有蚜虫蛋白，通过分析互作蛋白与PPTI结合后引起的反应，进一步完善抗蚜虫机制；通过转化月季获得高抗蚜虫的新种质，并利用基因改造、同源基因沉默等方法探究提升转基因植株内PPTI含量的方法。本研究的意义一方面可用于指导观赏园艺植物创制抗蚜新种质、新品种，另一方面也为高效、低毒、抗蚜生物杀蚜剂的研发奠定基础，PPTI后续研究进展对农业生产和环境改善具有重要的理论和现实意义。