新生儿耳聋基因检测的应用及临床意义研究

梁桂兰 梁洁莹 邹海珊 刘冬霞

中国的新生儿听力筛查工作最早开始于20世纪80年代末,到了2007年,中国人民解放军总医院将新生儿听力筛查内加入了聋病易感基因筛查的新理念,第一次提出新生儿听力和基因联合筛查整体实施流程以及操作系统,取得满意成绩。60.00%的新生耳聋者主要因遗传因素引起,在此其中2/3为迟发型耳聋［1］,该部分耳聋患者单凭听力发射法无法检测出。70.00%为非综合性耳聋,此类疾病有着高度遗传异质性,和GJB3,GJB2,SLC26A4,线粒体12SrRNA基因突变存在相关性。本实验回顾性分析2016年1月～2017年1月本院收治的57例非综合征性耳聋者为研究对象,全面分析新生儿耳聋基因检测的应用及临床意义,现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2016年1月～2017年1月本院收治的2000例新生儿为研究对象。均为出生3 d内新生儿。本实验经本院伦理委员会审查,患者符合卫计委最新颁布的关于耳聋诊断标准。争取家属知情同意之后,开展相关调查,其中包含出生史、家族史、个人史、病患母亲孕期体格检查情况等。

1.2 方法 耳聋易感试剂盒(PCR+导流杂交法)(潮州凯普生化学有限公司)、PCR扩增设备,全血基因组DNA提取试剂盒(潮州凯普生化学有限公司)。微阵列芯片扫描设备以及相关遗传性耳聋基因芯片辨别系统。PCR+导流杂交法开展实验。

PCR+导流杂交法能发挥芯片检测高通量优势,可在一块芯片中实现多个突变或者缺失基因检测,且结果判读无需进行昂贵设备或者复杂的序列分析,可直接观察斑点颜色改变判读结果。

①抽取2 ml新生儿脐带血,放置在EDTA抗凝管内。②使用厦门至善公司生产的全自动全血核酸提取仪试剂盒,对全血样本内的DNA进行提取,视为模板。③于PCR试剂Ⅰ中和试剂Ⅱ内加入到提取完毕的待测样本DNA 2 μl,总反应体系为25 μl,开展PCR扩增,条件为：50℃15 min,95℃10 min,94℃15 s,58℃30 s,72℃30 s,共进行35个循环,72℃5 min。④杂交：择取规格为15 ml的塑料离心管,放入带有编码的膜条,放入A液5～6 ml和PCR产物质,拧紧盖子,后将离心管拧松,以免在加热时爆裂。将离心管放在沸水内加热10 min,后取出,拧紧盖子,加入到杂交箱内以44℃环境杂交1.5～4.0 h。在50 ml塑料管内加入45 ml的B液,后放置在杂交箱内/水浴箱中,预热处理,直至44℃。⑤洗膜,移除模条,将其移植到装有B液的管内,在44℃环境下轻轻摇晃洗涤15 min,每管溶液数量为45 ml。最多能洗涤4张膜。⑥显色：将膜条浸泡在显色液内,避光存放5～10 min,后在使用纯水洗涤3～4次观察结果,记录好最终结果。⑦读取：依照膜条中的突变情况,判读结果。

1.3 质量控制 每次实验时,均设立正常对照和空白对照,操作和上述方式相同。

2 结果

2000例样本内,先天性耳聋患儿57例,26例为SLC26A4 IVS7-2A＞G杂合突变；3例为线粒体12SrRNA 1555 A＞G均质突变；28例为GJB2235delC/GJB2299delAT复合杂合突变。其中男40例,女17例。12例为两侧大前庭水管综合征。

3 讨论

耳聋为一种严重威胁人类身体健康的疾病。有统计证实,在新生儿群体内,该疾病的发生率为1‰,在该部分群体内,大约有近半数的新生儿因遗传性因素引起。在此其中有有75.00%～80.00%为隐性遗传,18.00%～20.00%为显性遗传,其余为X-连锁、线粒体或者染色体疾病导致。现如今,人类基因组计划已经完成,耳聋遗传学取得了突破性进展,诸多耳聋相关基因实现定位克隆,在这种环境下,耳聋疾病的临床基因诊断应运而生［3］。

遗传性耳聋致病基因和相同基因突变点存在种族不同特征,甚至在相同种族,不同地区的类型也不完全相同,其有着较强的种族特异性。有文献指出,接近21.00%的耳聋者为GJB2基因突变,而SLC26A4基因突变者为14.50%。线粒体12SrRNA 1555 A基因突变为3.80%,C1494T基因突变者占据0.6%。证实GJB2和SLC26A4基因突变以及线粒体基因为引起遗传性耳聋常见基因类型。在此其中,前两者为隐性遗传,而线粒体DNA则为母系遗传。此次研究中,共计57例异常。其和既往研究结果并不完全相同,而GJB2基因并非本地区遗传性耳聋的基因类型,还需要进一步研究证实［4］。

大前庭水管综合征为新生儿常见内耳畸形疾病。该疾病的主要症状为神经性耳聋,疾病发生时间较晚,病情加重多和感冒、头部外伤等存在相关性［5］。

早期研究证实,可经科学化指导以及限制活动,保存患者听力,基于此,检测耳聋基因诊断法被逐渐应用到临床中。研究证实：SLC26A4基因突变和LVAS疾病发生存在因果关系,该基因突变会造成非综合征性耳聋或综合征性耳聋。其中12例为两侧大前庭水管综合征。

研究指出［6-8］,线粒体A1555G突变会促进氨基糖甙抗生素和12SrRNA基因结合,进而引发氨基糖甙抗生素性耳聋,也能单独引起感音性神经性耳聋,其表型受到环境以及核基因背景、mtDNA单体影响。GBJ2基因突变为遗传性耳聋常见病因。由于该类型基因相关病变者的螺旋神经节细胞数量正常,长大后在适合于佩戴人工耳蜗。在植入人工耳蜗之后,患者的语言理解能力加强,由此可见,明确GBJ2基因突变型耳聋对于治疗和预后有着相当重要现实意义。

我国聋病分子流行病学调查研究证实：在中国聋人群体内有4.4%的患者携带线粒体基因突变,其在使用以链霉素为主的氨基糖甙类药物之后出现听力下降,倘若患儿未能取得针对性医学指导,其家属也很可能使用药物致聋［9］。经耳聋基因筛查,可及时发现以及预警携带药物聋敏感基因个体,通过积极有效的指导后,倘若患者以及家属能够终身禁用氨基糖甙类抗生素,就能避免药物性耳聋的发生以及由此引起的听力残疾。

本实验结果中可见,中国遗传性耳聋者中基因突变位点检出率较高,其能全面满足耳聋基因检测需要,联合现代产前诊断技术,能全面防止耳聋胎儿出生,有助于减轻家庭负担,另外,这项技术还有着迅速,精准,高通量等优势具备较为广阔的应用前景。