5—ALA—纳米金光动力治疗小鼠光老化的初步研究

葛芹 刘亚乐 李张军

[摘要]目的：初步探討5-ALA-纳米金光动力治疗小鼠皮肤光老化的作用。方法：48只雄性健康ICR小鼠分为正常对照组（8只）、光老化组（40只），正常组不予特殊处理，光老化组照射紫外线，肉眼观察和HE染色验证光老化模型。40只光老化组小鼠分为B组光老化对照组，C组红光组、D组纳米金组、E组5-ALA组、F组5-ALA-纳米金组，C、D、E、F组小鼠背部分别涂抹不同溶液0.5ml（分别为生理盐水、纳米金溶液、5-ALA溶液和5-ALA-纳米金组溶液）避光封包3h，红光照射10min，2周治疗1次，共治疗2次，A组为正常组对照组不予任何处理。观察各组小鼠皮肤表现和组织病理改变。结果：与A组比较，紫外线照射后，B组小鼠皮肤皮肤增厚，出现皮屑、深皱纹、缺乏弹性等光老化特征；组织切片显示，B组小鼠表皮厚度[（168.235±13.665）μm]较A组[表皮（87.165±2.627）μm]增厚（P<0.05），而胶原纤维面积密度[（7.390±2.5）%]均较A组[（40.114±3.0）%]明显减少（P<0.05）。与B组相比，C、D、E和F组小鼠的表皮变薄[分别为（154.458±2.942）μm，（114.958±2.229）μm，（50.623±4.203）μm和（31.694±1.970）μm，P<0.05]，胶原纤维面积密度增加[分别为（15.840±3.0）%，（27.320±2.5）%，（60.812±2.0）%和（70.024±3.0）%，P<0.05]，其中以F组效果最显著。结论：5-ALA结合体能提高光动力疗法治疗小鼠光老化的疗效，同时纳米金的光热作用可能用于治疗光老化。

[关键词]皮肤；光老化；光动力；纳米金；5-氨基乙酰丙酸；HE染色；胶原纤维；小鼠

[中图分类号]R751 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2018）11-0137-04

Abstract： Objective To primarily discuss the effects of using 5-ALA- nanogold for the treatment of photoaged mice irradiated with 640nm red light. Methods 48 ICR male mice are randomly divided into normal control group （8 mice） and photoaging group （40 mice） with ultraviolet irradiation，then we verify the success of photoaging mice models utilizing HE staining and gross inspection.Second A total of 40 photoaging mice are equally devided in five groups： photoaging control group（group B） receiving no treatment， red laser group （group C），nanogolds group （group D），5-ALA group （group E）and 5-ALA-nanogold group（group F）.The dorsal skin of group C，D，E and F mice are applied 0.5ml different kinds of solutions （respectively normal saline， nanogald， 5-ALA and 5-ALA-nanogold）， then receiving red light irradiation for 10min after covering with plastic mulch for 3 hours， and received a second treatment after two weeks. The normal control group without treatment is named as group A. The dorsal skin of each group mice are analysed by clinical manifestations and histopathologic changes. Results Compared with group A， the mice skin of group B shows the photoaging charactristics such as thickened and hardened skin， loss of resilience， deep winkles and dandruffs affter irradiation from UV. HE staining show the epidermis thickness of group B[（168.235±13.665）μm] is significantly thickener than group A[（87.165±2.627）μm] （P<0.05）， and the collagen fiber area density of group B [（7.390±2.5）%] is significantly reduction than group A [（40.114±3.0）%] （P<0.05）. The epidermis thickness of group C， D， E， F are respectively thinner than group B[respectivly （154.458±2.942）μm，（114.958±2.229）μm，（50.623±4.203）μm and （31.694±1.970）μm，P<0.05] and the collagen fiber area density of group C， D， E， F are significantly on the increase [respectively （15.840±3.0）%， （27.320±2.5）%， （60.812±2.0）% and （70.024±3.0）%， P<0.05] than group B， of which the most significant effect is group F. Conclusion 5-ALA and nanogold can cooperativly effect photodynamic therapy for photoaging mice skin and the photothermal effect of nanogold may be able to treat skin photoaging.

Key words： skin； photoaging； photodynamic therapy； nanogold； 5-ALA； HE staining； collagen fibers； mice

皮肤光老化是皮肤长期、反复暴露于紫外线所产生的皮肤早老征象[1]。许多临床试验研究证实5-ALA光动力疗法能有效治疗皮肤光老化[2]，其作用机制为光热作用，但5-ALA的亲水性限制其在组织和细胞膜间的通透性，影响光动力疗法的治疗效果。纳米金是粒径1～100nm的金颗粒分散体系，具有生物相容性和光热转换作用，即在一定光照下，纳米金能够吸收光，将光能转化为热能，传递给周围环境，使附近的物质温度升高[3]。研究表明纳米金可和皮肤屏障相互作用使皮肤渗透性增多，提高蛋白质类药物的经皮水分吸收[4]。为探索提高光动力治疗光老化疗效的方法，将5-ALA-纳米金结合体作为新型光敏剂[5]，经皮给药治疗光老化小鼠进行初步研究。

1 材料和方法

1.1 材料、试剂和仪器：健康普通雄性ICR小鼠48只，质量18～20g，清洁级（西安交通大学医学院动物中心，实验动物合格证号0014410，）。支链乙烯亚胺（BPEI）、5-氨基乙酰丙酸（ALA）（美国Sigma公司）。4-羟乙基哌嗪乙磺酸（C8H18N2O4S，HEPES）（北京鼎国昌盛生物技术有限公司），氯金酸（HAucl4-4H2O）（上海试剂一厂），紫外-可见分光光度计（DU-640）（日本JASCO公司），高分辨透射电子显微镜（JEM-200CX）、超速离心机（cp100wx）（日本HITACHI公司）、集热式磁力搅拌器（DF-101S）（郑州长城科工贸公司）、UVA灯管4支和UVB灯管2支（北京电光源研究所）、UVA和UVB型紫外线辐照计（上海希格玛高技术有限公司）、红光治疗仪（北京鼎国生物技术有限责任公司）、台式高速冷冻离心机（美国Beckmna公司）。

1.2 纳米金和5-ALA-纳米金结合体的制备和检测：采用BPEI还原法合成纳米金[6-7]，利用高分辨透射电子显微镜拍摄纳米金颗粒。ALA配制过程严格避光，ALA分子量为336g/mol，取0.0336g ALA加入2ml超纯水，所得ALA浓度50mmol/L。4℃冷藏避光保存备用。5-ALA含有氨基和羧基，在碱性条件下ALA带负电荷。纳米金颗粒表面带正电荷，利用静电引力可将5-ALA与纳米金颗粒相结合。

1.3 小鼠皮肤光老化模型的建立：将40W的4支UVB和2支UVA并列组装成木箱形成灯箱[8]，将小鼠置于距灯源30cm的灯箱中，实验前用UVA辐射计和UVB辐射计测量光强度。每次照光前将灯箱预热15min，每周3次。适应性饲养1周后，第2周照射时间为20min，以后每周增加10～20min，第7周照射时间90min保持不变直至第12周。（UVA辐照强度累计为150.30J/cm2，UVB辐照强度累计为24.75J/cm2）。

1.4 实验分组、处理和取材：将48只ICR小鼠随机分为A组正常对照组、B组光老化对照组，C组红光组、D组纳米金组、E组5-ALA组、F组5-ALA-纳米金组，每组8只。B、C、D、E、F组小鼠予以UVB和UBA照射12周。照光前3d，8%硫化钠去除小鼠背部毛发。每次治疗前2%水合氯醛（6μl/g） 腹腔注射麻醉实验小鼠，C、D、E、F组小鼠每只涂抹0.5ml不同溶液（分别为生理盐水、纳米金溶液、5-ALA溶液、5-ALA-纳米金结合体溶液），覆盖无菌棉球并以不透光黑色塑料薄膜封包固定，避光3h后将小鼠背部固定于距光源10cm的处置台上照光10min。2周后行第2次照光治疗。第2次照光2周后进行取材。

1.5 HE染色和胶原纤维染色：对各组皮肤组织行HE染色和胶原纤维染色，觀察组织改变。每组8只小鼠，每只小鼠皮肤做4张组织切片。在合适的倍镜下每张切片随机选取5个视野，用图像处理软件NDP软件测出表皮层厚度值。使用Image-Pro-Plus 6.0多媒体彩色病理图文分析系统检测Verhoeff铁苏木素法染色切片，在200倍放大下随机选取5个测定区域，按统一标准测定胶原纤维的面积密度值（目标面积/统计场面积）。

1.6 统计学分析：所有数据均用SPSS 21.0统计分析软件处理，数据用（x?±s）表示，各组间差异用单因素方差分析检验，并用LSD-t检验作两两多重比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 纳米金、5-ALA-纳米金结合体的形态和特征：电镜下制备所得的纳米金颗粒粒径大小均匀，直径约16nm，颗粒圆润，表面光滑，无团聚现象（见图1）。纳米金和5-ALA-纳米金结合体置于紫外-可见分光光度计检测，在可见光波段的吸收峰在530nm左右，当5-ALA的浓度增加到20mmol时，结合体的吸收峰出现了红移现象，吸收峰约535nm（见图2），说明5-ALA浓度过高，影响了5-ALA-纳米金结合体的稳定性，故本实验所用结合体中5-ALA的浓度为10mmol[5]。

2.2 大体观察及组织染色结果及分析

2.2.1 大体观察结果：A组小鼠皮肤薄，弹性佳，皮纹较细腻，可见静止性皱纹，无红斑；B组小鼠皮肤增厚变硬，弹性差，可见粗大的皱纹，中央可见红斑；C组和D组：小鼠皮肤厚度稍变薄，未见明显粗大的皱纹，仍可见静止性皱纹和红斑；E组和F组：皮肤变薄且弹性好，未见粗大皱纹及红斑，皮纹细腻，仍可见静止性皱纹。大体观察结果可知F、E两组未见明显差异。见图3。

2.2.2 HE染色结果：显微镜下可见A组表皮较薄，真皮胶原纤维排列均匀，细长且均一，真皮内腺体分布均匀。B组表皮颗粒层及棘层增厚，真皮层厚度明显降低，浅层血管扩张，炎症细胞浸润，胶原纤维排列紊乱，真皮内的毛囊增生，腺体排列紊乱。C组和D组表皮层厚度减少，真皮浅层胶原纤维增加，排列均一，真皮深层炎症细胞浸润，可见少部分粗大肿胀的胶原纤维，纤维排列紊乱。E组和F组表皮明显变薄，真皮浅层可见新生的胶原纤维，排列与表皮平行，真皮深层仍可见部分粗大纤维，未见明显炎症细胞浸润。增生的毛囊和腺体排列趋向于整齐。见图4。

2.2.3 膠原纤维染色结果：纤维镜下可见A组真皮层胶原纤维排列致密紧凑，均一。B组真皮层胶原纤维粗大、肿胀，结构稀疏紊乱，部分胶原断裂，浅层胶原纤维明显减少。C组和D组真皮浅层胶原纤维稍有增加，排列较均一，深层仍可见变性的胶原纤维，排列紊乱。E组真皮浅层可见明显新生的胶原纤维，平行于表皮，真皮深层仍可见部分粗大纤维。F组真皮浅层可见大量的波浪状，平行于表皮层均匀排列的新生胶原纤维，纤维细长且均一，真皮深层可见少量的粗大的、排列紊乱的胶原纤维。见图5。

2.2.4 小鼠皮肤表皮厚度和胶原纤维含量变化：B组小鼠皮肤表皮厚度明显增大，胶原纤维面积密度明显减小，与A组相比，差异有统计学意义（P<0.05）；分别与D组、E组、F组相比，小鼠皮肤的表皮厚度减小，胶原纤维面积密度明显增加，差异有统计学意义（均P<0.05）。而F组小鼠皮肤的表皮厚度、胶原纤维面积密度较E组和D组减小，差异有统计学意义（均P<0.05）。与C组小鼠相比，D组表皮厚度减小，胶原纤维面积密度增加，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

3 讨论

皮肤光老化的主要临床特征有皮肤粗糙、毛细血管扩张、色素沉着、细小和粗大皱纹、皮肤弹性降低和脆性增加[9]，组织学和电镜下可见表皮厚度增加，真皮胶原纤维减少、排列紊乱，和大量不规则分布、扭曲分布的弹力纤维[10]。目前国内外建造小鼠光老化模型的方法主要有照射时间与紫外线剂量两种方法，李张军等人利用自制装置成功改良建立小鼠光老化模型[8]。采用相同的装置照射ICR小鼠12周，肉眼观察到小鼠皮肤增厚、弹性差，局部可见粗大皱纹、红斑、鳞屑。HE染色镜下可见表皮颗粒层及棘层增厚，真皮浅层血管扩张、出血，炎症细胞浸润，胶原纤维减少，异常弹性纤维增加，毛囊增生。符合小鼠光老化模型的改变，说明成功构建了光老化小鼠模型[1]。

目前防治光老化的方法主要有涂抹防晒产品、口服或外用各种抗氧化药物、激光治疗和光动力疗法。与其他治疗方法相比，光动力疗法（Photodynamic therapy，PDT）既能改善皮肤的光老化，也能治疗和预防光损伤皮肤引起的癌前期病变和皮肤癌[11]。PDT治疗光老化的机制可能有3种[12]：①选择性剥脱作用：ALA-PDT可诱导光老化的成纤维细胞氧化损伤和凋亡[13]；②联合光热作用；③炎症反应：PDT治疗后，机体产生IL-1β、TGF-β、TNF-α等炎症因子和细胞因子产生炎症反应，启动皮肤创伤修复机制，促进胶原生成，重塑真皮[14-15]。限制ALA-PDT疗效最重要的因素之一是亲水性的5-ALA阻碍其在疏水性角质层的扩散，为提高ALA皮肤渗透性，许多方法已被证实有效，如点阵激光照射使皮肤形成微孔、电离子导入法、应用透皮吸收剂和将药物改为皮内注射等[16]。随着纳米技术的发展，纳米金由于良好的化学稳定性、生物相容性和独特的光学性质已被应用于DNA检测、肿瘤治疗、药物和基因载体等医学领域，而纳米金的光热疗法治疗肿瘤亦有很多报道。Riley RS等研究认为纳米金光热作用导致周围细胞DNA损伤和蛋白质变性，血管通透性和细胞之间的纳米金和其他药物的渗透性增加，提高相应药物的疗效[3]。Chen Z等研究显示真皮的成纤维细胞在一定程度的热刺激下活性增加，胶原蛋白合成增加[17]。光老化的皮肤屏障功能受损，角质层细胞间内聚力和机械完整性受损，表皮渗透性增加[18]，纳米金透过老化的皮肤，吸收红光后产生光热作用[19]。试验结果表明，与红光组和光老化组相比，纳米金组的表皮变薄，胶原纤维增多（均P<0.05），推测纳米金的光热作用在一定的范围内可能能刺激胶原蛋白合成增加，胶原纤维增加，表皮变薄。Hadizadeh M等研究发现纳米金与5-ALA结合协同抑制表皮类癌细胞的生长[20]，有研究证实纳米金能增强光敏剂单态氧产率[6-7，21]和5-ALA的稳定性[22]，同时5-ALA-纳米金协同增强PDT抗肿瘤作用[23]。本次试验结果表明5-ALA-纳米金结合体组较其他四组表皮厚度减小，胶原纤维增多（均P<0.05），提示纳米金作为载体使5-ALA透皮吸收增多，纳米金的光热作用和5-ALA-纳米金结合体增强光动力嫩肤疗效。本文通过5-ALA-纳米金结合体的制备和对动物实验结果的分析，初步证明了5-ALA结合体能提高光动力疗法治疗小鼠光老化的疗效，同时纳米金的光热作用可能能治疗光老化。

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[收稿日期]2018-06-15 [修回日期]2018-07-19

編辑/朱婉蓉