甘草液对大鼠牙周炎模型中BALP及BMP-4的影响

刘 丽，杨红梅，刘惠文，尹 东，王天鹏，封 静，袁晓超，俞海龙

在我国发病率逾为70%[1]的牙周炎疾病其主要病理变化是牙槽骨的吸收，从而加速了牙齿的松动脱落,基础治疗和手术不能完全控制病情迁延[2]。国内外学者在不同领域对甘草的研究表明，甘草具有抗菌、抗病毒、镇咳、抗癌、增强免疫力及促进骨的重建和代谢等诸多活性[3]。骨碱性磷酸酶(BALP)出现于骨基质成熟期，是骨形成中期指标，是成骨细胞膜上的一种蛋白，在骨形成及骨矿化过程中起很重要的作用。BALP在血中的浓度能反映骨形成的速率[4]。骨形态发生蛋白4(BMP-4)是转化生长因子TGF-β超家族成员之一，它在成骨细胞的增殖、生长、分化过程中具有诱导活性，进而加速破坏骨的修复重建，在骨形成初期具有极为关键的调节作用[5]。本研究将通过局部结扎丝刺激联合黏结牙石加混合菌感染大鼠牙周并高糖饮食的方法建立大鼠牙周炎模型[6]，然后对模型给予甘草液干预，并通过酶联免疫吸附法对建模前，建模后以及甘草水煎液干预模型后大鼠血清中骨代谢指标BALP、BMP-4进行检测分析，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料：选用清洁二级10周龄SD大鼠，雄性，体重(230±20)g。

1.2 药物及仪器：甘草饮片(购自宁夏古方中医药品超市)和蒸馏水1∶10(W∶V)混合，沸水回流5 h，滤渣后收集提取液。试剂：BALP和BMP-4酶联免疫试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技有限公司)。仪器为分光仪。

1.3 实验方法： ①将30只体重220～260 g雄性8周龄清洁级大鼠全部断尾取血1 mL并标记为第1组血样，将其全部离心取上清液-80 ℃保存。②随后将30只大鼠分为建模组26只和阴性对照组4只。建模组大鼠经10 g/L戊巴比妥3 mg/kg腹腔注射麻醉、固定。采用0.2 mm正畸用结扎丝结扎SD大鼠右侧上下颌磨牙牙颈部1圈，于颊侧拧紧，将结扎头置于牙龈沟内。此后将重度牙周病患者牙石碾碎，与其龈沟液混合刺入右侧上下颌磨牙颊舌侧牙龈，深度4 mm，并注满龈沟。以自身对侧同名牙作为正常对照，禁食水0.5 h。阴性对照组大鼠不做处理。③建模组大鼠给予高糖饮食喂养，阴性对照组大鼠适应性喂养，每日检查并记录，持续14 d。④建模组大鼠第14天出现右侧磨牙区牙龈组织红肿、触之出血、磨牙松动、牙周袋逐渐形成并加深、牙根暴露等牙周炎现象，而阴性对照组则没有明显变化。⑤第15天将29只大鼠(建模组死亡1只)断尾取血1 mL，标记为第2组血样，离心取上清-80 ℃保存。⑥将建模好的25只牙周炎大鼠模型分出19只为药物实验组，按600 mg/kg灌胃；另外6只为药物对照组，给予等体积生理盐水灌胃，均为每天1次，持续30 d。⑦阴性对照组4只大鼠，继续给予适应性喂养。⑧在第46天第3次对28只大鼠(药物实验组死亡1只)心脏取血1 mL，并标记为第3组血样，离心取上清-80 ℃保存。

1.4 检测指标：将3组大鼠血清对应标号，酶联免疫法检测血清中BALP、BMP-4。各程序按试剂盒说明书严格进行。

2 结果

2.1 大鼠牙槽骨吸收模型的评价：空白对照组大鼠口腔组织表现正常，牙龈无红肿、无牙周袋、无牙根暴露等。模型组大鼠第14天出现右侧磨牙区牙龈组织红肿，触之出血，磨牙松动，牙周袋逐渐形成并加深，牙根暴露现象明显。

2.2 血清BALP、BMP-4浓度测定：第3组血样建模组血清标本中BALP以及BMP-4浓度均高于第1、第2组血样浓度(P<0.05),第3组血样建模组血清标本中BALP以及BMP-4浓度高于药物对照组及阴性对照组(P<0.05)，见表1-表2。

表1 3组大鼠血清标本中BALP浓度的比较

表2 各组大鼠血清标本中BMP-4浓度

3 讨论

牙周炎是多因素引起的牙周支持组织的慢性炎症，发病率高，伴随其病变发展可诱发其他多系统发生病变，是危害人类健康的重要疾病之一。目前临床主要以牙周基础治疗为主，它仅能控制病变进展，对牙槽骨骨组织流失不能很好控制及逆转[7]。因此，对牙周炎治疗新策略的研发利用至关重要。血中骨代谢标志物水平检测是一种无创快速、灵敏和动态反映骨转换变化，对代谢性骨病的诊断、治疗以及在评价药物治疗效果中有不可替代的作用[8]。

本研究结果显示，在大鼠牙周炎模型建立前，所有血清中显示30只大鼠BALP、BMP-4之间的变化，差异无统计学意义；而第2组血清中显示BALP、BMP-4在阳性建模组中有较小的变化，但是数值高低没有明确的一致性，差异无统计学意义。分析原因可能是BALP、BMP-4在牙周炎模型中，由于在炎症刺激下，破骨细胞因子增加，而成骨细胞因子处于代偿性的对抗状态，则表现出少量的改变，再加上个体之间的差异，从而反应出不明确的变化。而阴性对照组与对应的第1组相比没有变化，结果可以体现出建模的成功及对大鼠BALP、BMP-4的影响。

而在第3组血清检测中，BALP、BMP-4有明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)，阴性对照组与第2组没有明显的变化，这充分证明了在甘草水煎液对大鼠牙周炎模型中骨吸收后又增殖的过程发挥了明确的促进作用。分析可能是甘草有效成分促进BALP及BMP-4的分泌，从而可以诱导未分化的间叶细胞向骨细胞转化。刘珊等研究显示，甘草液能抑制炎症造成的破骨细胞通路的激活，抑制骨的再吸收[9]；李明慧等研究显示甘草附子汤通过下调破骨细胞组织蛋白酶K(Cath K)的表达来抑制去卵巢大鼠骨组织中成骨细胞I型胶原(Col I)蛋白的降解，增加骨小梁的数量，改善骨小梁的结构，减低骨的转换率，从而达到甘草附子汤对绝经后骨质疏松预防的目的[10]。

Mattarello MJ等研究显示，甘草酸能增加甲状旁腺激素的水平，从而调整骨代谢[11]；Choi EM等研究显示，甘草酸可以增加小鼠胚胎成骨细胞MC3T3-E1的活性，以及ECM骨信号传导通路[12]；Sasaki H等研究显示，甘草液还可以抑制在缺乏IL-10所造成的大鼠牙周炎模型中NF-κb的转录活性，从而抑制骨吸收的信号通路[13]；Somjen D等研究显示甘草液可以促进雌激素的活性，从而促进骨细胞的增殖[14]。通过国内外研究分析，甘草液可以通过多种途径调整骨代谢，促进骨细胞的增殖。本研究结果与这些结论相一致。

综上所述,通过本实验证实甘草水提液能促进大鼠实验性牙槽骨吸收后骨再生转化因子BALP、BMP-4的增殖，从而为进一步研制治疗牙周炎牙槽骨骨吸收的中药奠定了理论基础。甘草到目前已分析出300多种有效成分，具体哪种成分对牙槽骨的细胞增殖有促进作用还有待进一步研究。

[1] Silva N，Abusleme L，Bravo D，et al.Host response mechanisms in periodontal diseases[J].Journal of Applied Oral Science，2015，23(3):329-355.

[2] Shankar Ram V，Parthiban，Uma Sudhakar，et al.Bonebiomarkers in Periodontal Disease:A Review Article[J].Clin Diagn Res，2015，9(1):7-10.

[3] Jung JC，Lee Yunhee，Kim SH，et al.Hepatoprotective effect of licorice，the root of Glycyrrhiza uralensis Fischer，in alcohol-induced fatty liver disease[J].BMC Complementary and Alternative Medicine，2016，16(16):19.

[4] Yue Song，Hao Tan，Kejian Liu，et al.Effect of fluoride exposure on bone metabolism indicators ALP，BALP and BGP[J].Environ Health Prev Med，2011 ,16(3):158-163.

[5] 孙伟方，王晔恺，刘晓光，等.血清骨形成蛋白-4水平与异位骨化的关系研究[J].中医正骨，2012，24(6)：37-41.

[6] 张艳，孙汉堂，汪平，等.对大鼠牙周炎模型中骨吸收的诱导与自然转归情况的观察[J].牙体牙髓牙周病学杂志，2013，5：294-297.

[7] 吴贾涵，杨萍，李绍岳，等.补肾固齿丸辅助牙周基础治疗的牙槽骨改变的研究[J].全科口腔医学电子杂志，2015，1：81-84.

[8] 李士红，刘阳.骨关节病变及骨折患者围术期骨代谢标志物检测及骨密度变化[J].中国组织工程研究，2016，20(35)：5290-5295.

[9] 刘珊.异甘草素经自噬途径抑制破骨细胞功能及机制[D].武汉：武汉大学，2016.

[10] 李明慧，王桂敏.甘草附子汤对去卵巢大鼠骨组织中Ⅰ型胶原代谢及组织蛋白酶K表达的影响[J].中国生化药物杂志，2011，32(5)：356-359.

[11] Mattarello M，Benedini S，Fiore C，et al.Effect of licorice on PTH levels in healthy women[J].Steroids，2006，71(5):403-408.

[12] Chol EM.Liquiritigenin isolated from Glycyrrhiza uralensis stimulates osteoblast function in osteoblastic MC3T3-E1 cells[J].International Immunopharmacology，2012，12(1):139-143.

[13] Sasaki H，Suzuki N，Alshwaimi E，et al.18 beta-Glycyrrhetinic acid inhibits periodontitis via glucocorticoid-independent nuclear factor-kappa B inactivation in interleukin 10 deficient mice[J].Journal of Periodontal Research，2010，45(6):757-763.

[14] Somjen D，Katzburg S，Vaya J，et al.Estrogenic activity of glabridin and glabrene from licorice roots on human osteoblasts and prepubertal rat skeletal tissues[J].Steroid Biochem Mol Biol，2004，91(4/5):241-246.