基于太赫兹光谱分析的猪肉K值无损检测方法

齐 亮 赵茂程 赵 婕 唐于维一

(1.南京林业大学机械电子工程学院, 南京 210037; 2.南京师范大学分析测试中心, 南京 210046;3.泰州学院, 泰州 225300; 4.南京工业职业技术学院航空工程学院, 南京 210023)

引言

我国猪肉消费量占肉类消费总量的77%[1]。猪肉的品质包括营养成分、风味、嫩度、保水性和新鲜度等要素[2-3]，其中，新鲜度是一个重要品质指标。新鲜度测定通常有2种方法，感官评定法和理化分析法。感官评定法主观因素大，重复性差；理化分析法精确可信，重复性高[4]。理化分析所测定的新鲜度指标包括肉色[5-6]、微生物指标[7-8]、挥发性盐基总氮指标[9-10]、K值(品鲜度)[11]、pH值[12-13]和聚胺类化合物质量浓度[14-15]等，其中，基于ATP分解过程的K值被证实是可行的，且越来越受到重视[16-17]。

K值通常采用高效液相色谱分析法(High performance liquid chromatography, HPLC)获得[18-19]，虽然此种理化分析法准确且可信，但是过程耗时、对被测样品具有破坏性，不能满足生产和流通环节中快速和广泛性测量要求，用无损检测方法测定猪肉的K值成为科研工作的一个重要研究热点。

目前，猪肉新鲜度指标的无损检测方法有近红外光谱分析以及可见-近红外高光谱图像分析方法，这些方法均基于与猪肉新鲜度相关的化学物质在可见和近红外波段有特征表达的原理，建立猪肉新鲜度无损检测的数学模型，实现了新鲜度的快速和比较准确的测定[20-23]。

但是，利用远红外波段光谱数据无损检测猪肉新鲜度的方法却鲜有报道。太赫兹波(Terahertz, THz)位于毫米波和红外线之间，属于远红外波段，频率在0.1～10 THz范围内[24]。从能量上看，THz波处于电子和光子之间。THz波的多元化特性使得很多化学分子在THz波段下表现出在其他波段下所不具备的分子运动特性[25]。核苷酸类(如ADP、ATP)及其相关物质(如IMP)属于生物小分子，在THz波段的吸收主要是由于其分子自身的转动、振动或分子集团的整体振动，有THz波谱特征结构，在THz波段存在多个吸收峰[26-27]。

本文以K值为研究参数，通过探索猪肉新鲜度的THz光谱特性，建立THz光谱数据与猪肉K值之间的关系模型，实现对猪肉K值的快速无损检测，研究一种猪肉新鲜度快速无损检测方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为冷鲜猪肉的通脊肉，每天上午从当地超市购买，用冷藏箱运回实验室后，将猪肉均匀切割成2.5 cm×2.5 cm×0.5 cm的肉片。取样时避开猪肉的脂肪和结缔组织，以防止这些成分对THz检测结果的干扰。将猪肉样品用保鲜袋包好并编号后置于4℃冰柜中贮藏待测。连续采集8 d的肉样为一个试验周期。在第8天的下午，完成8个肉样的THz光谱采集以及K值测定。重复试验10个周期，得到80个肉样的光谱数据和理化值。

1.2 THz光谱采集

THz检测设备型号是TAS7500SP (日本Advantest公司)，在室温(25℃)环境下工作，频率分辨率为7.6 GHz，检测频率范围是0.2～4 THz，共498个采样频率点(波点)，样品谱线经过2 048次自动扫描并取平均值后得到。

THz与水有强烈的相互作用，对于富含水的肉样透射深度只有几百微米，所以透射模式不适合肉制品新鲜度无损检测，反射模式也会因为反射波被水吸收而无法检测。用THz衰减全反射 (Attenuated total reflectance, ATR)检测模式，可以克服样品中富含的游离水以及结合水对THz波的强烈吸收，使得样品表面微米级厚度化学物质的THz特性能够反映在THz全反射波的光谱里[28]。ATR检测附件的光路如图1所示，THz波进入ATR晶体后发生了全反射，反射后的THz波含有与反射面接触的样品表面THz光谱信息。

图1 ATR附件光路示意图Fig.1 Schematic diagram of optical path in ATR module1.THz波 2.ATR晶体 3.样品 4.ATR检测窗

每个样品从冰箱取出后，去除包装，将样本平整放入ATR检测窗表面。样品的上、下2个表面分别采集3次THz光谱数据，每个样本能够获得6份THz光谱数据，将6份光谱数据取算术平均值，作为该样本的最终THz光谱数据。因为THz光谱仪对温度和湿度比较敏感，所以光谱采集时，保持实验室内温度、湿度基本一致。

1.3 K值测定

猪肉中的一些物质随保存时间的增加而变质，在宰后的肉品中，三磷酸腺苷(ATP)会自动分解：三磷酸腺苷(ATP)→二磷酸腺苷(ADP)→磷酸腺苷(AMP)→次黄嘌呤核苷酸(IMP)→肌苷酸(HxR)→次黄嘌呤(Hx)。

据ATP分解过程，测定K值的指标方程为[16]

(1)

式中CATP——样品中ATP浓度

CADP——样品中ADP浓度

CAMP——样品中AMP浓度

CIMP——样品中IMP浓度

CHxR——样品中HxR浓度

CHx——样品中Hx浓度

可见，肉品越是新鲜，K值越低，反之K值越高。采用HPLC方法检测肉制品中的K值。根据流动相中ATP分解的关联产物(ATP、ADP、AMP、IMP、HxR和Hx)在固定相中的不同流速，将这6种化学组分分离，分别测得这些组分的含量，根据式(1)计算出被测样品的K值[19]。本文采集完样本THz光谱数据后立即对同一样本进行K值测定。

用于K值检测的样品前处理过程如下：将被测样品剁碎成肉泥，从中取(2.00±0.05) g放入50 mL离心管内,加入冷却后的10%高氯酸溶液20 mL,涡旋振荡1 min,以8 000 r/min 速度离心10 min,取出上清液。再用5%高氯酸溶液20 mL 重提沉淀物中的待测物,以8 000 r/min 速度离心10 min,合并上清液。用10 mol/L的NaOH溶液调节提取液pH值近6.0,然后再用1.0 mol/L的NaOH溶液继续调节pH值至6.0～6.4,再用超纯水定容至50 mL。用0.45 μm的微孔滤膜过滤, 滤液于4℃下保存, 待测。

HPLC条件如下：Finnigan Surveyor型液相色谱仪(美国Thermo-Fisher公司)，AQ-C18型色谱柱(美国Thermo-Fisher公司)，流动相为0.05 mol/L的K3PO4缓冲液(pH值6.5)，缓冲液用超纯水配制，样品的进样量1 μL, 流速200 μL/min,检测波长254 nm。ATP分解的关联产物由外标法定量，测定范围为0～0.5 mmol/L。

试验中使用的试剂如下：ATP关联物(ATP、ADP、AMP、IMP、HxR和Hx)共6种标准品(纯度99%以上, 美国Sigma-Aldrich公司)；磷酸钾、氢氧化钠、高氯酸(分析纯, 国药集团化学试剂有限公司)；试验用水为Millipore Academic型超纯水器制备的超纯水。

2 结果与分析

2.1 K值分析

采用HPLC法获得80个样本的K值，统计分析结果如表1所示。通过样本的平均值可以看出，随着储存时间的增加，新鲜度不断降低，样本的K值逐步增加，但增加量不是固定的。其中， 5～6 d、6～7 d的增加量相对较大，说明在上述存储周期内，肉样的品质变化程度较大；感官评价也证实肉样在6～7 d存储周期内，触摸较黏，有明显的酸味，因此可推测肉样在此周期内新鲜度显著下降。本试验所有样本的K值覆盖了猪肉的不同新鲜度，覆盖范围广，有助于使本文最终建立的THz光谱预测K值模型有较好的鲁棒性。

表1 HPLC测得的K值Tab.1 K values measured by HPLC

80个样本被随机分为54个校正集和26个预测集，个数比大致为2∶1。其中校正集用于建立THz光谱预测K值的数学模型；预测集用来检验所建立的模型预测未知样本K值的准确性。通过表2可以看出，校正集、预测集和样本总集合的K值范围基本相同，平均值和标准差也没有明显区别，因此校正集和预测集的样本分割是合适的。

表2 校正集与预测集的K值统计信息Tab.2 Statistic information of all samples in calibrationand prediction sets

2.2 光谱预处理

肉样的同一表面在相同的测试条件下连续测量6次，获得6条THz光谱，理论上这6条光谱应该完全重合，但由于仪器的噪声及测试误差的影响，连续重复测得的6条光谱不可能完全重合。为了评价光谱质量，可以计算同一样品表面连续重复测试ns次获得的ns条光谱的标准方差光谱(Standard variance spectrum of repeat spectral, SVSRS)，SVSRS值越小，说明光谱质量越好[29]，公式为

(2)

式中xkj——第k次测量样本在波点j处的ATR反射率

Sj——波点j处的SVSRS值

图2a是某个肉样表面在0.2～4 THz的6次THz光谱，图2b是该光谱对应的SVSRS，从图中可以看出在2～4 THz的SVSRS值明显增高，重复性差。故选择0.2～2 THz作为建模的光谱频段。图3a是80个样本在0.2～2 THz区域的THz光谱谱线，可以看出，不同猪肉样本的原始光谱强度有很大的差异。光谱的差异不仅包含了样本成分的差异，还包括测量误差、基线漂移和背景噪声。为了消除干扰信息，除了尽可能保持试验环境因素一致外，还须对光谱数据进行预处理，以减弱或去除各种干扰因素。

图2 THz光谱波段选择Fig.2 Scope selection of THz spectra

图3 THz光谱预处理Fig.3 Preprocessing of THz spectra

本文采用一阶导数(First order derivative，FD)预处理光谱数据，一阶导数能够减少基线偏移、漂移和背景干扰造成的数据偏差，使得与新鲜度密切相关的光谱特性变得更为显著[30-31]。由于导数计算会增加噪声，故导数预处理之后采用Savitzky-Golay (SG)多项式平滑光谱[32]。在求导过程中，差分宽度选择十分重要：宽度过小，噪声会过大，影响所建模型的质量；宽度过大，平滑过度，会失去大量的细节信息[33]。图3b为经过15点一阶求导和SG平滑后得到的一阶导数光谱图。

2.3 猪肉K值预测模型

由上文论述可知，猪肉腐败过程中会使K值相关的ATP关联产物的含量发生变化，而这些生物分子对THz波具有灵敏的光谱响应，THz光谱能够反映出这些生物分子含量的变化。因此THz光谱数据与猪肉的新鲜度之间存在一种间接的关联性。本文使用线性算法——主成分回归(Principal components regression，PCR)和偏最小二乘回归(Partial least squares regression，PLSR)以及非线性算法——反向传播神经网络回归(Back propagation artificial neural network, BP-ANN)分别验证这种关联性，并试图找到一种THz光谱预测猪肉K值的数学模型。评价模型质量的指标有校正集相关系数RC、校正集均方根误差EC、预测集相关系数RP和预测集均方根误差EP[34]。相关系数RC和RP越大，EC和EP越小，则模型的预测能力越好。本文使用Matlab R2009b(美国Mathworks 公司)软件对光谱数据进行计算与建模。

2.3.1主成分回归PCR预测模型

本试验中的每一条光谱都含有250个波点，光谱的波点数远大于样本数，如果直接用于回归分析，会出现过拟合，降低模型的预测精度和稳定性。同时光谱波点的数据间存在较高的共线性和相关性，也会使得回归模型的结果产生失真。可以通过主成分分析法(Principal component analysis，PCA)对光谱信息进行压缩，通过少数几个主成分的得分来近似反映原光谱数据，消除光谱数据点的信息冗余和相关性[35]。

本文用PCA法将预处理后的光谱矩阵进行主成分分解，取累积贡献率达到95%的主成分集合作为预测模型的输入。根据预测模型达到最高RP和最低EP时选择光谱预处理的差分宽度。

模型计算表明当一阶差分宽度为15时，累积贡献率95%的主成分集合数为26，PCR的预测性能最佳(RP=0.63,EP=16.78%)，如图4a所示 。图4b是PCR模型在此参数条件下的K值预测散点图。

图4 PCR模型的预测结果Fig.4 Results of PCR model

2.3.2PLSR预测模型

PLSR不仅与PCR一样都对光谱矩阵进行主成分分解，还对参考变量(K值)进行主成分分解，并且在迭代分解时考虑两者的线性相关性，迭代分解后的潜变量(Latent variable, LV)能够最大程度反映光谱矩阵的信息，并使得光谱矩阵和参考变量的相关性达到最大化。潜变量数采用留一交叉验证法选取，即选取交叉验证均方根误差(Root mean square error of cross validation, RMSECV)值最小时的潜变量数[36]。根据这一原则，考察预测模型在预处理差分宽度3～47范围内，潜变量数在1～20的范围内，RMSECV的数值变化情况，如图5a所示。可以看出，预处理差分宽度为31且潜变量数是5时，RMSECV数值最小，为19.12%，PLSR的预测性能最佳。图5b是PLSR模型在此参数条件下的K值预测散点图。

图5 PLSR模型的预测结果Fig.5 Results of PLSR model

2.3.3BP-ANN预测模型

BP-ANN能够模仿延伸人脑的认知功能探索并构建输入信号与输出信号之间的复杂联系。BP-ANN一般使用多层前馈神经网络。本文使用的神经网络拓扑结构分为3层：输入层、单隐含层和输出层。为了降低神经网络训练的复杂度，采用PCA方法将预处理后的光谱矩阵进行主成分分解，取累积贡献率达到95%的主成分集合作为神经网络的输入，输出层为一个节点，即预测K值。单隐含层的节点数由经验公式得出[37]，即

(3)

式中mh——隐含层节点数

mi——输入层节点数

mo——输出层节点数

a——1～10范围内的常数

据此隐含层节点数范围选择为4～17。训练神经网络前，输入的光谱矩阵被归一化至-1～1的范围内，实测K值被归一化至0～1的范围内。隐含层的传递函数是“logsig”(S型对数函数)，输出层的转移函数是“tansig”(双曲正切S型传递函数)，BP网络的训练函数为trainlm(Levenberg-Marquardt 训练函数)。因为隐含层的节点数会影响神经网络预测的性能，所以采用留一交叉验证法选取，即选取RMSECV值最小时的节点数[38]。根据这一原则，考察预测模型在预处理差分宽度3～25范围内，隐含层的节点数在4～17范围内，RMSECV的数值变化情况，如图6a所示。可以看出，预处理差分宽度为13且隐含层节点数是9时，RMSECV数值最小，为18.1%，BP-ANN模型的预测性能最佳。图6b是BP-ANN模型在此参数条件下的K值预测散点图。

图6 BP-ANN模型的预测结果Fig.6 Results of BP-ANN model

2.4 THz光谱预测模型的比较

表3系统比较PCR、PLSR、BP-ANN 3种THz光谱预测K值数学模型的性能，可以看出，非线性模型BP-ANN的预测性能明显优于线性模型PCR和PLSR。其原因可以通过以下方面来解释：

表3 3种K值预测模型的回归结果比较Tab.3 Regression result comparison of K value forthree models

(1)在线性模型中，PLSR模型的预测结果劣于PCR模型的预测结果。可能的原因是，PLSR模型在校正集的建模拟合过程中过多地考虑了光谱矩阵和参考变量的相关性，导致校正集建模出现了过拟合，所建模型在预测集中的预测性能出现了明显下降。

(2)非线性模型BP-ANN预测结果最优。可能的原因是，K值由ATP的6种关联物含量的比值决定，这些分子物质的含量与THz光谱中的谱线数据是非线性关系，而且各分子物质在THz光谱中也是互相重叠的[27]。所以非线性模型能够在建模过程中通过自学习和自调整方法拟合非线性关系，所建立的预测模型会比线性模型更优秀。通过较优模型可以进一步推断,光谱数据预处理的差分宽度选择13(BP-ANN模型)或者15(PCR模型)是合适的,差分宽度过小或者过大都会降低模型的预测性能。

(3)非线性模型BP-ANN有进一步完善的空间。样品成分复杂，吸收光谱中未见有明显的吸收峰或者特征波段，可以设计更优算法，滤除与新鲜度无关的物质对THz光谱的影响，从复杂成分的THz光谱中提取与K值相关度更大的特征波段，研究出更适合K值和THz光谱的复杂非线性关系模型，进一步提高预测精度。

3 结束语

采用ATR全反射模式，在0.2～2 THz范围内获取冷鲜猪瘦肉表面的THz光谱数据，经一阶微分和SG平滑滤波处理后构建数学模型，快速无损检测猪肉K值，以评价猪肉新鲜度。3种预测模型PCR、PLSR、BP-ANN的比较研究表明，相比线性PCR、PLSR模型，尽管非线性BP-ANN模型有进一步完善的空间，但能更好地拟合THz光谱数据和新鲜度K值之间的复杂非线性关系，最适合于K值预测，其预测相关系数达到0.75，预测集均方根误差达到14.36%。基于相同的THz检测原理，THz光谱分析法还应能无损检测其他肉类(如鸡肉、牛肉、鱼肉等)的K值。此项研究为基于此方法开发设计便携式检测设备提供了理论基础。

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