贵州糯质小麦的分子标记辅助育种研究

程 斌， 辛智海， 高 旭， 隋建枢， 曹 宁， 丁延庆， 何庆才， 张立异

（1.贵州省农业科学院旱粮研究所， 贵阳550006； 2.贵州大学生命科学院， 贵阳550025）

在水稻、玉米和高梁等谷类作物中都存在由自然变异形成的糯性类型，并有糯性品种（系）应用于生产。然而，同为谷类作物的普通小麦，迄今为止自然界尚未发现其糯性类型。1993年日本学者发现，在控制小麦的籽粒直链淀粉合成中，有一种酶起着主要作用，这种酶就是颗粒结合淀粉合成酶（Granule－bound starch synthase I，简称GBSSI），也称 Waxy蛋白。直链淀粉含量较高的小麦存在Waxy蛋白，而直链淀粉含量很低的小麦缺少甚至没有 Waxy蛋白，Waxy蛋白的存在与否决定着谷物的糯性和非糯性，编码Waxy蛋白的等位基因被命名为Wx基因。普通六倍体小麦（Triticum aestivumL.，AABBDD）含有3种Wx 蛋白亚基：Wx－A 1、Wx－B 1和 Wx－D 1，分别位于染色体7 AS、4AL和7DS上，它们相应的表达型等位基因为Wx－A1a、Wx－B1a、Wx－D1a，相应的缺失型为 Wx－A1b、Wx－B1b、Wx－D1b［1］。任一种蛋白亚基的缺失或失活可导致直链淀粉含量降低，一方面可能是更多物质参与支链淀粉合成，导致直链淀粉合成的绝对量下降；另一方面可能是直链淀粉含量下降，支链淀粉含量不变，导致直链淀粉相对量的减少。3个蛋白亚基均存在天然缺失，如日本小麦品种关东107缺失Wx－A 1和Wx－B 1蛋白亚基，中国地方品种白火麦缺失 Wx－D 1蛋白亚基，其相应基因被分别命名为Wx－A1b、Wx－B1b和Wx－D1b。Nakamura等［2］在关东107小麦和白火麦杂交后代中选育出了世界上第一个直链淀粉含量在0.6%～0.7%之间的糯小麦。

糯小麦的低直链淀粉含量这一特性使其在面条加工业、淀粉加工业及其它工业上有着重要的用途。比如可以提高面条的品质；低直链淀粉品种穗不易发芽，避免收获前的产量损失，还能避免加工中α－淀粉酶活性升高造成的面粉质量下降；糯小麦的面粉可以用于配粉，提高面条的品质，改善馒头的白度，延长速冻食品的货架寿命；糯小麦还可以用于生产环保塑料、糯米纸类食品包装纸、硬纸板、浓缩剂、浆糊、涂料原料、纺织业的打浆剂等；特别是糯小麦在酿酒方面具有较大利用价值。赵国君等研究表明，在酒厂生产条件下，糯小麦白酒有相对较高的出酒率和杂醇类物质含量、适中的酸类和酯类物质含量、较低的醛类物质含量，糯小麦白酒在气味和口感方面优于其它试验组白酒［3］。贵州是白酒的主产区，对酿酒原料需求大，选育出适应贵州种植的酒用糯小麦，在改善贵州白酒品质的同时，还可以增加农民收益，实现双赢的局面。

分子标记辅助育种技术（Marker Assisted Selection，MAS）是利用与目标性状紧密连锁的DNA分子标记对作物目标性状进行间接选择，在早代就能够对目标基因的转移进行准确、稳定的选择，而且克服隐性基因再度利用时识别的困难，从而加速育种进程，提高育种效率，选育抗病、优质、高产的新品种。MAS技术在小麦的分子育种中得到了广泛应用。在糯小麦的 MAS中，舒守贵等［4］以中国春糯性位点全套近等基因系为研究材料，用小麦Wx基因的6个STS标记和1个CAPS标记进行了筛选；张晶等［5］对173份小麦的蛋白质亚基进行分子标记扫描并构建了多重 PCR；王亮等［6］利用 Wx－A 1、Wx－B 1和 Wx－D 1位点的3个STS标记对250份新疆小麦品种Wx基因的组成进行了鉴定，同时测试了185份冬、春小麦品种的淀粉糊化特性。

为了提高适应贵州生产的抗病糯小麦的育种效率，本实验采用 Wx－B1、Wx－A1、Wx－D1基因的分子标记［7－8］，对本地优良品系与糯小麦的杂交后代进行Wx基因鉴定与筛选，评估分子标记在糯质小麦MAS育种中的应用，为加快糯性小麦新品种的选育奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

本实验采用小麦品系俞糯麦、自育品系0117以及杂交F2代的56个单株为试验材料。俞糯麦为不携带任何3个Wx基因的全糯质小麦材料，由重庆地区农科所提供。自育品系0117是一个综合性状较好并具有良好抗性的完全非糯质小麦品系，由贵州省农业科学院旱粮研究所选育并提供。

1.2 Wx基因检测标记

实验中使用的3对Wx基因分子标记中，与等位基因Wx－A1a／b和Wx－D1a／b连锁的标记是SSR标记，而与Wx－B1a／b连锁的标记是STS标记。它们名称、序列信息及扩增片段大小如表1所示。

1.3 DNA提取及PCR分析

亲本及群体种子发芽，幼苗培养至一叶一心，基因组DNA的提取采用CTAB法［9］，略做改动，将DNA样品稀释到50ng／μL备用。

PCR 扩增SSR 引物根据http：／／www.graingenes.org公布的引物序列，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。在 MJ Research PTC－200型PCR仪上进行扩增反应。PCR反应体系（15μL）：DNA 模板5.0 μL；10×Buffer 2.0μL；MgCl21.2μL；2.5mmol／L dNTP 0.4μL；10mmol／L 引物各0.8μL；2.5U／μL Taq酶0.2μL；ddH2O 4.6μL。

基本反应条件：94℃3min；94℃2min，58℃／61℃1min（视引物退火温度而定），72℃2min，35个循环；72℃延伸10min；10℃保存。取3μL扩增产物在6%非变性连续PAGE上恒压（130～150V），电泳2～2.5h，银染，凝胶自动成像系统观察、照相。或者取12.5μL扩增产物在0.8%的琼脂糖胶上100V，电泳30min，EB染色，凝胶自动成像系统观察、照相。

表1 Wx基因的分子标记

1.4 统计学分析

本研究利用Excel软件对实验数据进行统计和卡方验证分析。卡方验证是将实际比数与理论比数进行比较，以确定二者的符合程度，从而确定某一分离比例是否能用某种遗传规律去解释。计算公式为：

卡方值（X2）＝（观测值－理论值）2／理论值。

2 结果与分析

2.1 Wx基因标记扫描结果

自育品系0117是完全非糯质小麦，其基因型为Wx－A1a、 Wx－A1a／Wx－B1a、 Wx－B1a／Wx－D1a、Wx－D1a，而俞糯麦是全糯质小麦，其基因型Wx－A1b、Wx－A1b／Wx－B1b、Wx－B1b／Wx－D1b、Wx－D1b。利用与3个糯质基因Wx－A1、Wx－B1和Wx－D1紧密连锁的分子标记 Mag 264、BDFL／BRD和 Mag 269扫描2个亲本以及56个F2代的单株，结果如图1所示。

Mag 264为共显性标记（SSR），获得2个扩增片段分别为336bp和317bp，其中317bp片段与糯质等位基因位点Wx－A1b连锁。56个F2后代中，10个单株携带非糯质的等位基因位点Wx－A1a，基因型为Wax－A1a、Wax－A1a，为非糯质小麦；14个单株携带糯质的等位基因位点Wax－A1b，基因型为Wax－A1b、Wax－A1b，为糯质小麦；其余25个单株是杂合体，基因型为Wax－A1a、Wax－A1b，为非糯质小麦，另外有7个单株未检测到条带。利用卡方检验，在显著水平p＞0.05时，X2＝0.714，说明该位点在F2代群体分离比符合AA∶Aa∶aa＝1∶2∶1的分离比（图1，表2）。

BDFL／BR为显性标记（STS），PCR扩增产生一个425bp片段，与非糯质的等位基因Wx－B1a紧密连锁。56个F2后代中，32个单株携带此片段，说明它们的 基因型 为Wx－B1a、Wx－B1a 或Wx－B1a、Wx－B1b，应为非糯性小麦；24个单株没有此位点，说明其基因型为Wx－B1b、Wx－B1b，为糯性小麦。利用卡方检验，在p＞0.05时，X2＝0.002，说明F2代分离比符合（BB＋Bb）∶bb＝3∶1（图2，表2）。

Mag 269为共显性标记（SSR），但是在PCR扩增产物结果中却表现为显性标记，可能是Wx－D1基因3’端大片段缺失的杂合体DNA结构会影响PCR的扩增［8］，PCR 扩增获得2个片段分别为1 400bp和800bp，其中800bp片段与糯质基因Wx－D1b连锁。56个F2后代中，22个单株携带非糯质的等位基因位点Wx－D1a，为非糯质小麦；34个单株携带糯质的等位基因位点Wx－D1b。该位点在F2代的分离符合DD∶（Dd＋dd）＝1∶3的分离比（X2＝0.136，p＞0.05）（图3，表2）。

图1 标记Mag 264在品系0117和俞糯麦的F2代群体部分单株的PCR扩增产物

图2 标记BDFL／BR在品系0117和俞糯麦的F2代群体部分单株的PCR扩增产物

图3 标记Mag269在品系0117和俞糯麦的F2代群体部分单株的PCR扩增产物

表2 F2后代Wx基因位点扫描结果

续表2

2.2 F2代群体中糯质小麦出现的频率

对3个标记的扫描结果进行统计分析发现，在56个F2代分离群体中，3个基因位点都存在的材料有4株（7.14%）；单缺失 Wx－A1a 或 Wx－B1a 或 Wx－D1a基因位点的材料编号分别为5（8.93%）、8（14.29%）和19（33.93%）；Wx－A1a 和Wx－B1a 基因位点同时缺失的材料为5株（8.93%）；Wx－A1a 和 Wx－D1a 基因 位点 同 时 缺 失 的 材 料 为 4 株 （7.14%）；Wx－B1a 和Wx－D1a基因位点同时缺失材料为11株（19.64%）；3个基因位点都缺失的全糯质单株未发现。

3 讨 论

贵州酿酒的历史悠久，糯小麦具有良好的酿酒特性，但是贵州省内缺乏具有推广价值的糯性小麦，省外引进的糯质小麦品种易感条锈病、白粉病和赤霉病等病害，无法适应贵州的生态气候环境，因此选育综合性状优良、产量高的糯性小麦新材料拥有巨大市场前景和科研价值。糯性小麦鉴定方法很多，比如利用半粒种子可以进行碘染色检测，但只能鉴定糯与非糯，无法鉴定部分糯小麦类型。改良的Waxy蛋白SDS－PAGE电泳方法虽简化了步骤，降低了成本，但Wx－B1和Wx－D1迁移率非常接近，仍难以区分，且该方法需要破坏种子，在大量筛选和分离后代检测中的应用也受到限制。Wx－A1b、Wx－B1b和Wx－D1b都是隐性基因，利用传统育种通常需要较长的育种年限；并且当只有1～2个隐性基因存在时，即使纯合体也很难根据表型对其进行直接选择。因此，分子标记辅助选择是培育不同支链淀粉含量小麦品种的最有效方法。

近年来，根据Wx基因的已知序列，相继开发出了3个位点的分子标记［7－11］和这些分子标记在基因型鉴定中具有快速、准确和简单等诸多优点，在植株整个发育时期和任何部位均可取材检测。段军［12］利用糯质基因分子标记鉴定出12个株系的全糯蓝粒小麦；马红勃［13］以扬麦17（红皮）和扬麦01－2（白皮）2个背景的wx基因近等基因系，对不同遗传背景和栽培环境下材料的品质特性进行了研究；许立奎等［14］利用多重PCR技术鉴定F2代群体内的糯质基因；杨芳萍等［15］利用糯质基因分子标记对甘肃小麦糯质蛋白分布进行研究，结果表明Wx－B1b基因从西向东南部逐渐降低；普布卓玛［16］通过杂交、回交以及自交等方法将3个糯蛋白缺失基因聚合在一个小麦遗传背景中。

本研究利用糯质基因特异分子标记，在F2代分离群体内发现单个缺失Wx基因材料的数目依次为Wx－D1a最 多、Wx－B1a 其 次、Wx－A1a 最 少，但 是 未能发现同时缺失3个Wx基因的全糯质小麦株系，这应该与分离群体较小有关。根据孟德尔分离定律，位于不同染色体上3个等位基因（Aa／Bb／Dd）的分离情况中，3个隐形等位基因同时出现的频率为1.56%（1／64）。由于F2代分离群体只有56个，3个隐形基因同时出现的理论值应该等于0.875，所以在群体中没有检测到同时缺失3个Wx基因的株系也属正常。理论上1 000个F2代群体只能获得16株全糯小麦，如果还需要考虑抗病和高产等其他性状，F2代群体还需要进一步增加。因此，为了选育具有较好综合性状的抗病全糯质小麦，需要扩大候选群体大小（＞2 000），或者利用部分糯性小麦品系间的杂交，比如F2代群体内单缺失wx－A1a的5个单株与缺失wx－B1a＋wx－D1a的11个单株杂家，再利用回交、聚合杂交等方法提高全糯质小麦的选育效率。

4 结 论

本次实验采用自育品系0117和俞糯麦作为亲本，对他们的杂交后代利用Wx基因分子标记筛选糯质小麦。在显著水平p＞0.05时，3个糯质基因在F2代中的分离比例符合预期比例，并检出了不同Wx基因组合的小麦单株，但是未能检测出3个基因都缺失的全糯质小麦单株。本研究结果表明，在生产实践中利用标记辅助选择技术，结合传统的育种经验，可以加快贵州省高产、糯质小麦的创新及应用。

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