栀子开花生物学特性和人工去雄授粉研究

王晓云， 徐 旭， 王鹏良

（1.江西中医药大学， 南昌330004； 2.江西民族传统药现代科技与产业发展协同创新中心， 南昌330004；3.江西省中药种质资源工程技术研究中心， 南昌330004；4.广西壮族自治区林业科学研究院， 南宁530002）

栀子（Gardenia jasminoides Ellis.）是茜草科多年生灌木，在我国广泛分布于中部及以南各省区。据《中国植物志》记载［1］，栀子包括2个变种，一个是黄栀子（Gardenia jasminoides Ellis var.jasminoides），通常简称为栀子；另一个是重瓣栀子（G.jasminoides Ellis var.fortuniana（Lindl.）Hara.）。黄栀子又变异为2个类型，一类通常称为“山栀子”，果卵形或近球形，较小；另一类通常称为“水栀子”，果椭圆形或长圆形，较大［2］。山栀子可以用作药材，是药典规定种。水栀子一般不作为药用，主要用作染料或色素提取。重瓣栀子不结果实，又名白蟾，主要用于园林栽培。

栀子在国内的栽培面积很大，江西、广西、福建等省均有种植基地。栀子种下变异异常丰富，例如，果型有大、中、小果之分，果卵形、近球形、椭圆形或长圆形；叶的形态有大小及长圆状披针形、倒卵状长圆形、倒卵形或椭圆形等差别；分枝上有短、长枝和稀疏、密集之分；冠型上有宽大、矮小和窄长等区别。形态上的差异对果实产量有一定的影响，也为育种提供了丰富的材料。

前期从全国各地的栀子资源中，筛选了2种形态差异显著、产量等性状表现优良的类型，一种为高枝大果型，典型特征是植株较高、果实大、果实长形、叶片大、单株结果数量少、开花晚、花期长、开花时间可延续到8月份；另外一种为矮枝小果型，典型特征是植株矮小、果实小、果实近球形、单株结果数量多、开花早、花期短，在6、7月份集中开放。本研究以这2种类型的栀子和重瓣栀子为材料，对它们的花粉活力和柱头可授性进行了测定。根据测定结果，选择合适时期人工去雄后，进行正反交授粉，为探讨通过优良品系的有性杂交，进行品种选育提供科学依据和育种材料。

1 材料与方法

1.1 植物材料

高枝大果、矮枝小果型栀子和重瓣栀子种植在江西中医药大学。将栀子花朵分成5个发育时期（图1），每个发育时期的花朵各取3朵，立即带到实验室中，分离雄蕊和雌蕊，进行花粉活力和柱头可授性检测。同时，取完全开放的重瓣栀子进行检测。

1.2 花粉活力检测

用氯化三苯基四氮唑（2，3，5－tri－phenyl－tetrazolium chloride，TTC）染色法测定花粉的活力和寿命［3］。用0.2mol／L pH＝7.2的磷酸缓冲液将TTC配制成1%的染色液，并加入30mg／L的蔗糖，蔗糖浓度参考栀子花粉离体萌发的最佳培养基浓度［4，5］。

用毛笔蘸取花粉涂抹在载玻片上，滴加染色液，迅速盖上盖片，置入内有湿滤纸的平皿中，连同平皿放置在37℃黑暗条件下2h。在显微镜下，统计盖片中央部位3～5个视野中红色花粉占全部观察花粉粒的比例。花朵发育的第5个时期，肉眼未见散出的花粉，则用镊子轻轻划开花丝，然后浸泡到载玻片上面的染色液中，再置于显微镜下观察。

1.3 花粉离体萌发检测

用人工培养法［4，5］检测花粉萌发情况。培养基为0.8% 琼脂＋30mg／L蔗糖＋15mg／L硼酸＋15g／L PEG－6000＋2.0mmol／L CaCl2，将培养基倒在培养皿中，把花粉均匀弹洒到凝固的培养基上，室温下暗培养4h后，在Nikon CI－S型生物显微镜下观测花粉情况，统计萌发率。花粉萌发以花粉管伸长超过花粉直径为标准。每处理重复3次，每重复观察5个视野，每个视野花粉粒数不少于50粒。在花朵发育的第5个时期，肉眼未见散出的花粉，则用镊子轻轻划开花丝，然后涂抹培养基于花丝上，再置于显微镜下观察。

花粉萌发率（%）＝萌发花粉数／总花粉数×100%。

1.4 柱头可授性检测

用联苯胺－过氧化氢法测定柱头的可授性。染色液的配制方法是：1%联苯胺∶3%过氧化氢∶水＝4∶11∶22（体积比）。用毛笔蘸蒸馏水将花粉粒刷去，再浸入凹面载片，载玻片上含有联苯胺－过氧化氢反应液。立即置于显微镜下观察，若柱头具可授性，则柱头周围的反应液呈现蓝色并有大量气泡出现。

图1 不同发育时期的栀子花朵（以高枝大果型为例）

1.5 人工去雄杂交

将高枝大果型和矮枝小果型栀子互为父母本，人工去雄后进行正反交。在母本花朵尚未开放时（图1，第1个时期）去除雄蕊。首先，用解剖刀沿着花苞中部竖向划一刀直到花瓣底部，割破花瓣（注意不要碰到花药和雌蕊），然后在花瓣上部1／3处横向划一刀，去除上部1／3的花冠，再沿着竖向切口，用镊子剥开花瓣，小心抽出每一根雄蕊（镊子不要触碰花柱和柱头）。要将雄蕊整条抽出，若是断裂了需要将残留的部分去除干净；注意不要使花粉囊破裂，若是破裂可用蒸馏水冲洗柱头。去掉雄蕊后，将花瓣恢复原来的状态，继续包裹并保护柱头。用硫酸纸袋给去雄后的整个花朵套袋并挂标签，记录去雄时间。气温、降雨、遮阴情况和花朵着生位置等均会影响柱头和花药的发育速度，去雄3d左右检查柱头发育情况，待柱头完全变成黄色，且有粘液产生时进行授粉。取第3个时期的父本花朵进行人工授粉。用干净的毛笔刷小心蘸取花粉，涂抹在母本已去雄花朵的柱头上。授粉后给母本继续套袋，记录授粉时间。授粉3d后除去套袋，等待果实发育成熟。期间可将未经人工授粉的果实摘除一些，并施肥防止落果；喷洒农药防治病虫害，锄草培土，加强田间管理。

1.6 杂交后代的收获和种子发芽

霜降前后收获深红色的果实，小心剥出种子，将残余的果肉冲洗掉。将种子摆放在铺有滤纸的培养皿内，用1.2mg／mL浓度赤霉素溶液于30℃黑暗条件下浸泡2d破除休眠［6］，然后用蒸馏水冲洗3遍，除去赤霉素，更换新的滤纸，再按照标准发芽试验程序进行发芽，每天定时给种子换水，直至种子露白为止。

2 结果与分析

2.1 栀子花部特征和开花习性观察

《中国植物志》记载，栀子的花芳香，通常单朵生于枝顶，花冠白色或乳黄色，花丝极短，花药线形，长1.5～2.2cm，伸出；花柱粗厚，长约4.5cm，柱头纺锤形，伸出，长1～1.5cm，宽3～7mm。花期3～7月，果期5月至翌年2月［1］。

根据观察（图1，表1），高枝大果型和矮枝小果型栀子的花药和花柱贴生，等高。柱头由2～3心皮构成，每个心皮有几条突起的纵棱。心皮合生处有凹槽。第1个时期花朵已经开放，花瓣内外表面均为白色；第2个时期花朵半开放，花苞顶端已经完全松开，花瓣内表面为白色，外表面大部分为白色，仅边缘残留有淡绿色；第3个时期花朵即将开放，花苞顶端即将松开，花瓣内外表面为白色，但边缘残留有淡绿色；第4个时期花朵尚未开放，花瓣内表面为白色，外表面彼此重叠的部分为白色，暴露在阳光下的部分为绿色。以上4个时期花朵的花粉囊均已破裂，散出黄色的花粉粒。第5个时期花朵的花冠为深绿色，花瓣内外表面都是绿色，花苞紧闭，花冠紧紧包裹柱头和花丝，柱头为绿色无粘液产生，花丝和花药为乳白色，花粉囊尚未破裂。在花朵发育的5个时期，随着花朵逐渐成熟，花冠由紧紧包裹花药和柱头逐渐变得松散直到完全开放；柱头的外表面（包括心皮上的纵棱和纵棱间的沟）逐渐由绿色变为淡黄色，最后变成黄色；心皮合生处的凹槽由绿色逐渐变为淡绿色，再转变成黄色。完全成熟开放的花朵，心皮合生处的凹槽与柱头外表面均为黄色，并产生大量粘液。另外，在花朵发育的第5个时期，花药尚未散粉；随着花朵逐渐成熟，可散出大量黄色花粉粒。

表1 栀子花朵发育5个时期花器的形态变化

重瓣栀子花朵未开放时，柱头畸形，几乎不可见；即将开放时，花苞外表面绿色，花瓣内表面白色，未见柱头，花丝和花药极小，未见散粉；完全开放时，柱头很小，花丝花药也小，但能够散出极少量黄色的花粉。

2.2 花粉活力检测

在花朵发育的5个时期，高枝大果型和矮枝小果型栀子的花粉粒均以复合花粉的形式存在，4个单粒花粉聚合在一起，称为四合花粉。TTC染色后，第1～4个发育时期的花粉粒形态完整、清晰，大小均一，均能染成红色（图2A）。在第5个时期，可以观察到极少量形态完整、大小正常但未能染色的花粉粒，表明有极少量花粉粒尚未成熟。

重瓣栀子花朵完全开放时，极少量成熟的花粉粒形态完整、清晰，大小正常，也为四合花粉，可以染成红色。大部分是形态较小的单粒花粉或复合花粉，未能染色，表明花粉畸形，活力低下（图2B）。

2.3 花粉离体萌发检测

图2 TTC法检测栀子和重瓣栀子花粉活力（目镜10×）

在花朵发育的5个时期，高枝大果型和矮枝小果型栀子的成熟花粉粒在离体培养条件下均能正常萌发。随着花朵发育成熟度下降，萌发率也下降，未成熟花粉粒逐渐增多。前4个时期下降不明显，在最后一个时期，矮枝小果型栀子花粉粒萌发率迅速下降，高枝大果型略有下降（图3、图4）。重瓣栀子发育正常的花粉粒数量极少，未能检测萌发情况。

图3 不同发育时期高枝大果型桅子花粉萌发情况

图4 不同发育时期矮枝小果型桅子花粉萌发情况

2.4 柱头可授性检测

剥下高枝大果型和矮枝小果型栀子的柱头，浸泡到染色液中，进行柱头可授性检测。柱头心皮合生的凹槽处均立即有肉眼可见的气泡产生。随后，构成凹槽的2条纵棱逐渐变蓝，凹槽表面和其他纵棱也随之变蓝。显微镜下可见纵棱处有大量气泡产生。在5个发育时期，随着花朵成熟度降低，柱头浸泡在染色液中产生的气泡逐渐变小，数量逐渐减少，柱头变色速度减慢，表明柱头成熟度降低。将完全开放的重瓣栀子的柱头浸泡在染色液中，无变色，显微镜下仅观察到极少量气泡。

2.5 果实收获和种子发芽率

2种优良的栀子类型互为父母本，人工去雄后正反交授粉，共获得43个果实，果实中种子的数目为16～517，发芽率为0～100%（表2）。

3 讨 论

栀子是喜光和喜温植物。气温在26℃以上时，若是天气晴朗，往往集中在下午开放。早晨花苞紧闭，花瓣外表全部呈现为绿色；16：00时左右，花苞外表开始“露白”，花瓣边缘白色部分显露出来，花苞顶端松开，露出缝隙，并有清香散发，吸引许多小虫爬进爬出，属于虫媒花。随着花瓣逐步展开，花冠逐渐转变成白色，花朵迅速开放。它的柱头庞大，花药明显，去雄和授粉操作较容易完成；花器构造和开花特征使其兼具自花授粉和异花授粉的优势。人工授粉后，每个栀子果实中均含有种子多数，但其中有大量种子的胚或胚乳败育。授粉时雌雄配子状态可能是影响种子质量的主要因素之一。关于栀子杂交育种的研究未见报道，准确把握花朵授粉的生理条件和环境条件，有利于提高栀子人工去雄授粉后种子的质量。

许多植物的柱头从开花到具有可授性在形态上会发生一定变化［7］。栀子为雌雄异熟植物，花朵尚未开放时，雄蕊和雌蕊已经成熟。其中，花粉粒成熟较早，包裹在未裂开的花药中。随着雄蕊由白色转变为淡黄色最终变为黄色，庞大的柱头也由绿色转变为黄色并产生大量粘液，过氧化物酶活性明显增强，具备了花粉萌发所需的生理条件。待到花朵开放，花药已经提前开裂并完成授粉。刘丽仙等对栀子受精过程进行了详细的观察，结果表明，自然授粉后的第6天可见到花粉管长入珠孔进入胚珠的内部，双受精作用的完成是在授粉后的第12天［8］。根据本研究的观察，光照和温度对栀子开花和自然授粉的过程影响很大，可以加速或者延缓以上过程。

表2 栀子种子发芽率

一般来说，植物花朵盛开的当天，花粉粒的活力最强。本研究结果表明，在花朵发育早期栀子花粉粒就已经成熟，具备了萌发能力。进行人工去雄后杂交时，选择即将开放的花朵作为父本（此时花粉粒已经成熟），选择柱头尚未发育成熟且未开放的花朵去雄，待柱头完全成熟时再进行授粉。以上措施既避免了自交和外源花粉粒的污染，又使得花粉粒和柱头处于成熟的生理状态下，有利于获得发育良好的杂交种。

郝 大 翠 等 对 狭 叶 栀 子 （G.jasminoides Elli var.angusti folia Nakai）、大 花 栀 子 （G.jasminoides Elli var.grandiflora Nakai）和栀子的花粉粒育性进行了研究，结果表明，栀子的花粉粒育性最高，可育花粉粒的百分率约为99%，是另外2种栀子的2倍还多［9］。而且，栀子花粉母细胞的减数分裂几乎完全正常，花粉的可育性最高，果饱满，结实率高，而2种作为观赏用栀子的减数分裂存在异常，花粉可育性低，结实率极低或不结实。本研究结果表明，重瓣栀子不结实的原因包括花器畸形、花粉粒少且败育，是否存在染色体行为异常，尚需进一步研究。

［1］罗献瑞.中国植物志（第一版）［M］.科学出版社，1999，71（1）：332.

［2］中国药材公司编.中国中药资源志要［M］.北京：科学出版社 ，1998，717.

［3］胡适宜.植物胚胎学实验方法（一）花粉生活力的测定［J］.植物学通报，1993，10（2）：60－62.

［4］叶利民.PEG和钙对栀子花粉萌发的影响［J］.种子，2012，31（7）：35－37.

［5］徐芬芬，张翠香，叶璐.蔗糖和硼酸对栀子花粉萌发特性的影响［J］.上饶师范学院学报，2011，31（3）：79－81.

［6］颜升，罗光明，朱玉野，等.栀子种子萌发条件优化及萌发抑制物的初步研究［J］.南方农业学报，2014，45（3）：376－382.

［7］钟国成，张利，杨瑞武，等.丹参及其近缘种花粉活力与柱头可授性研究［J］.中国中药杂志，2010，35（6）：686－689.

［8］刘丽仙，王美华，史安民.栀子受精作用的观察［J］.中草药，1992（5）：266－268.

［9］郝大翠，惠荣奎，程志号，等.药用栀子和二种观赏型栀子的细胞学研究［J］.北方园艺，2010（11）：193－196.