非对称二甲基精氨酸与纤维化的研究进展

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(中南大学湘雅药学院药理学系，湖南 长沙 410078)

纤维化是由于纤维结缔组织在炎症或受损组织及其周围过度累积，导致组织结构紊乱及功能受损的病理过程。纤维化是肝纤维化、肾纤维化、肺纤维化和心脏纤维化等大多数慢性疾病的重要病理特征，已经成为影响人类健康的一大类疾病。在工业化国家，45%的死亡病例与纤维化有关。因此，探明纤维化的相关机制，寻求有效治疗方案已成为亟待解决的医学问题。

非对称二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine, ADMA)可竞争性抑制一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)，减少一氧化氮(nitric oxide,NO)的产生。多项证据表明，ADMA不仅在预示心血管并发症的发生乃至死亡方面具有重要意义，还能诱导纤维化相关因子如转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)的表达和胶原蓄积，在组织纤维化的发生、发展过程中发挥重要作用。本文就近年ADMA对纤维化影响的研究进展综述如下。

1 ADMA的合成、代谢和排泄

ADMA主要由含有精氨酸残基的蛋白质，经蛋白质精氨酸甲基转移酶(protein-arginine methyltransferases, PRMT)甲基化修饰形成。PRMT有PRMT I和PRMT II两种亚型，主要存在于细胞核中，并在RNA加工和转录过程中发挥作用。真核生物中有3种甲基精氨酸亚型：单甲基精氨酸(NG-monomethyl-L-arginine，L-NMMA)、对称性二甲基精氨酸(symmetric dimethylarginine, SDMA)和ADMA。PRMT I产生ADMA，PRMT II产生SDMA和L-NMMA。ADMA和L-NMMA均为NOS抑制物，通过与L-精氨酸竞争NOS活性结合位点，抑制NO生成。SDMA为ADMA的同分异构体，对NOS无明显抑制作用。由于血浆中ADMA的浓度约为L-NMMA的10倍，因此，ADMA被认为是机体内主要的NOS抑制物。

ADMA在体内经二甲基精氨酸二甲胺水解酶(dimethylarginine dimethylaminohydrolase, DDAH)水解、丙氨酸乙醛酸氨基转移酶(alanine-glyoxylate aminotransferase-2, AGXT2)代谢和肾脏排泄。其中大约80% 的ADMA在DDAH作用下代谢为二甲胺和瓜氨酸。DDAH有DDAH1和DDAH2两种亚型，分别由不同基因编码。DDAH1分布于表达nNOS的组织如大脑、肾脏，主要调节体内ADMA水平，而DDAH2主要分布于表达eNOS和iNOS的组织中如血管、心脏、脾，其作用在于维持血管内皮功能。肾脏在体内ADMA排泄中发挥重要作用。正常人体内每天产生约300 μmol ADMA，其中约50 μmol ADMA以原型经肾脏排出体外。在肾脏中，ADMA可经AGXT2代谢清除，过表达AGXT2能促进ADMA代谢，调节NO合成。

2 ADMA和纤维化

纤维化是多种组织病理性重建的标志，也是患者致残、死亡的重要原因。在生理情况下，细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的生成和降解在组织中存在着动态平衡。在各种致病因素的作用下，细胞因子、生长因子、炎症介质、趋化因子释放增多，成纤维细胞、骨髓或血液中的纤维细胞、内皮细胞和平滑肌细胞等被激活或分化成为肌成纤维细胞。肌成纤维细胞分泌胶原的能力很强，可分泌大量ECM，组织表现出ECM生成与降解失衡，并转化为纤维化，最终导致器官衰竭[1]。

纤维化反应非常复杂，涉及TGF-β、血小板衍生生长因子、结缔组织生长因子、血管紧张素II和内皮素-1等信号传导途径和调节系统。其中，TGF-β在绝大多数纤维化疾病过程中发挥着关键作用。TGF-β不仅在肾、肝、肺等多种组织器官纤维化中显著增高，还能诱导成纤维细胞等多种细胞合成和分泌ECM蛋白并抑制其降解。

2.1 ADMA和肾脏纤维化慢性肾脏疾病(chronic kidney disease，CKD)患病率在全世界范围内呈明显升高趋势，已成为全球性公共健康问题。肾脏纤维化是各种CKD进展至终末期肾衰竭的共同途径。肾脏纤维化的本质是肾组织损伤后的“疤痕化”修复。它主要通过炎性细胞浸润、肌成纤维细胞的活化与增殖、ECM的大量合成与异常沉积和肾小管萎缩与管周毛细血管网匮乏这4个组织学核心事件，导致肾实质损害和肾功能丧失。

多项研究表明ADMA是终末期肾脏疾病的独立风险标志物，其水平异常可引起肾间质缺血和肾间质纤维化[2-3]。对164例CKD患者，随访一年，发现ADMA升高是3-4期CKD患者肾功能损害的强预测因子[4]。在单侧输尿管结扎的肾小管间质纤维化大鼠模型中，DDAH1表达下调，PRMT1和ADMA水平显著升高，且ADMA水平与肾胶原纤维面积百分比呈正相关性[5]。在血管紧张素II诱导肾小球、肾间质纤维化大鼠模型，ADMA会导致肾小管周围毛细血管丢失、肾血流量减少，从而诱发肾小管间质缺血、肾脏慢性缺氧和纤维化，最终加速肾脏损伤，而增加DDAH表达(静脉注入以腺病毒为载体的DDAH基因)可减少肾微血管丢失，改善肾间质缺血和肾间质纤维化[2]。在5/6肾脏切除诱导肾小管间质纤维化大鼠模型，ADMA会导致肾小球毛细血管丢失和硬化，过表达DDAH可以抑制TGF-β表达的上调，从而延缓肾小球损害[3]。这些研究表明ADMA可促进肾纤维化的发生与发展。

纤维化是以ECM增多和异常沉积为主要特征。TGF-β1被认为是体内促ECM大量合成与异常沉积最重要的诱导因素，在绝大多数纤维化疾病过程中发挥着关键作用。研究显示，在培养的人肾小球内皮细胞，ADMA可呈浓度依赖性上调TGF-β1 mRNA和蛋白水平[6]。MIHOUT等[7]用微泵向单侧肾切除大鼠泵入ADMA，发现ADMA水平升高可引起TGF-β1表达上调，并促进胶原I、胶原III及纤维连接蛋白蓄积，最终导致肾间质纤维化和肾小球纤维化。进一步研究发现，ADMA可使缺氧诱导因子及其下游靶分子内皮素-1表达增加，导致TGF-β表达上调，使管周毛细血管稀疏、肾脏慢性缺氧，诱导肾纤维化[7]。ADMA类似物单甲基精氨酸(NG-Nitro-L-arginine Methyl Ester，L-NAME)亦被报道能引起TGF-β合成增加，而应用血管紧张素受体抑制剂氯沙坦能抑制TGF-β合成、延缓肾脏纤维化[8]。因此学者们推测ADMA 有可能通过活化Ang II促进TGF-β合成，进而诱导肾脏纤维化。此外，纤维化过程中异常激活的细胞如内皮细胞、平滑肌细胞也可导致TGF-β表达上调，促进ECM蛋白和α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)合成，进而导致胶原蛋白异常沉积[1]。在大鼠肾成纤维细胞和肾小球系膜细胞，ADMA可促进成纤维细胞和系膜细胞转化形成肌成纤维细胞，进而增加ECM蛋白如纤连蛋白和α-SMA的表达，导致肾细胞损伤[9]。在肾小管上皮细胞中，DDAH1过表达显著减弱了醛固酮诱导的E-cadherin下调和α-SMA上调，减弱上皮间质转化相关分子Snail2，Twist1，Zeb1和Zeb2的mRNA水平上调，并显著降低细胞外ADMA水平[10]，提示DDAH/ADMA通路亦可能通过调节肾脏多种细胞上皮细胞间质转化，进而促进肾纤维化。

2.2 ADMA和肝脏纤维化肝纤维化是继发于肝脏炎症或损伤后组织修复过程中的代偿反应，其特征是ECM在肝内的过度沉积。肝纤维化进一步发展可引起肝小叶改建、假小叶和结节形成导致肝硬化。

肝脏是体内代谢ADMA的重要器官。DDAH在肝脏中高表达，肝功能受损时体内ADMA水平显著增加。多项研究显示ADMA与肝纤维化的发生发展密切相关。在四氯化碳诱导肝纤维化的小鼠或大鼠模型，肝脏DDAH1表达下降，PRMT1和ADMA水平显著升高，并伴随胶原沉积、纤维化标志物α-SMA表达增加以及内皮标志物CD31表达下降，且ADMA水平与肝胶原纤维面积百分比呈正相关[5,11]。在四氯化碳诱导肝纤维化的大鼠模型中，选择性类固醇法尼醇X受体激动剂可以降低TGF-β、纤维化蛋白标志物I型胶原与α-SMA的表达，同时上调DDAH1和eNOS的表达，使肝巨噬细胞浸润减少，降低肝纤维化面积[12]。另有研究发现，在四氯化碳或胆管结扎诱导的肝纤维化模型中，NO水平下降，使阻力血管紧张性增加，促进肝硬化门脉高压症形成，而ADMA为内源性NOS抑制物，可抑制NO生成，提示ADMA可能通过抑制NO途径引起肝血窦和肾小管周围毛细血管收缩和微循环障碍，加重血管内皮细胞损伤，导致肝纤维化。

肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)位于肝窦内皮细胞与肝细胞间的窦状隙(Disse腔)内，肝脏受损时被激活转化为肌成纤维细胞，后者具有收缩和合成大量ECM的功能。因此，HSC的激活被认为是肝纤维化发生的中心环节。目前认为，TGF-β是诱导HSC激活和刺激其分泌ECM作用最强的细胞因子，在肝纤维化的发生发展中起关键作用。最新研究显示，在培养的大鼠HSC细胞中，TGF-β1可明显抑制DDAH蛋白表达，增加ADMA含量。另有研究表明，在培养的HSC细胞，ADMA能呈时间和浓度依赖性上调TGF-β mRNA水平，同时增加α-SMA阳性细胞数和I型胶原合成[13]。上述研究提示ADMA与TGF-β相互作用可能介导肝星状细胞激活，进而促进肝纤维化[13]。

2.3 ADMA和肺纤维化肺纤维化是一种慢性，进展性和破坏性的间质性肺病，其特征在于肺泡上皮细胞凋亡导致肺泡结构破坏和成纤维细胞、肌纤维母细胞与平滑肌细胞等的过度增殖，从而引起ECM过度沉积和气体交换受损。因此，肺泡上皮细胞凋亡被认为是导致肺纤维化的关键环节。

多项研究显示，ADMA可能在肺纤维化的发生发展中发挥重要作用。在培养的肺上皮细胞，ADMA可以直接诱导细胞凋亡，促进肺纤维化。WELLS等[14]通过渗透泵向小鼠连续注射ADMA，发现其可直接引起小鼠肺脏胶原沉积，导致肺血管重构、诱导肺纤维化。另外，肺纤维化易导致肺血管重构，诱发肺高压。在野百合碱诱导的慢性肺高压大鼠模型或特发性肺动脉高压患者，血浆和肺组织中ADMA水平均显著增加[15]。这些研究提示ADMA可促进肺纤维化的发生发展。

DDAH是代谢ADMA的主要途径。文献报道，DDAH可能与肺纤维化的发生发展密切相关。在博来霉素诱导的肺纤维化小鼠中，内皮细胞、炎性细胞、成纤维细胞、气道上皮细胞和肺泡上皮细胞中均可检测到DDAH1和DDAH2表达增加，同时伴随肺部胶原大量沉积[16]。类似的结果在特发性肺纤维化(Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)患者中得到进一步证实。IPF是肺纤维化最常见和最具侵袭性的形式。在这个过程中，IPF可能导致肺泡毛细血管和肺结构的进行性丧失。PULLAMSETTI等[16]发现在IPF患者的肺部，不仅可检测到DDAH表达增加，并且可以观察到纤维化瘢痕，隔膜增厚和成纤维细胞病灶。进一步的研究发现，在DDAH1过表达的小鼠，其肺纤维化症状亦明显重于博来霉素诱导的肺纤维化小鼠。在博来霉素诱导的肺纤维化小鼠，应用DDAH siRNA或DDAH抑制剂L-291或者选择性NOS2抑制剂L-NIL，可降低肺纤维化小鼠中肺部胶原过度沉积，并减少肺泡上皮细胞的异常增殖，改善肺功能[16]。上述研究表明，DDAH可促进肺纤维化的发生与发展。此外，研究亦发现在博来霉素诱导的肺纤维化小鼠，应用ADMA处理对博来霉素诱导的肺纤维化无明显影响，而DDAH抑制剂L-291则可显著降低博来霉素诱导的肺纤维化小鼠的肺纤维化程度，提示DDAH是以非依赖ADMA的方式促进肺纤维的发生与发展。然而，WELLS等[14]报道，ADMA可以诱导肺纤维化。上述研究结果的差异，尚不清楚，有可能是因为在两个研究中肺纤维化所处的病理阶段不同。在博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型，早期ADMA浓度是明显增加，第7天达高峰，随后其开始下降，故推测早期的肺纤维化可能主要由ADMA发挥作用，而后期则主要通过DDAH的非ADMA途径。

2.4 ADMA和其他纤维化心肌纤维化是指ECM过度沉积于心肌组织中导致疤痕形成和组织结构紊乱，最终导致心肌组织破坏。心肌纤维化主要分为反应性血管周围纤维化(心肌纤维化的早期阶段，表现为胶原沉积在心脏冠状动脉周围)，间质纤维化(胶原由冠状动脉周围扩展到生理状态下无胶原存在的肌间隙)和修复性或替代性纤维化(表现为心肌细胞周围胶原沉积增多和胶原类型发生改变)。持续性心脏肥大或大量心肌细胞的突然丧失可触发心脏纤维化，导致心脏的病理性重塑和衰竭。研究发现，慢性肾病患者血清的ADMA浓度显著增加，外源性应用尿毒症患者血清中分离的ADMA处理人冠状动脉内皮细胞，可导致间质转化相关转录因子Slug和Twist水平上调，促进冠状动脉内皮细胞发生间质转化，从而促进心肌纤维化[17]。通过渗透泵向小鼠泵入ADMA可引起野生型小鼠冠状动脉微血管中膜增厚及血管周围纤维化[18]。在DDAH2过表达的转基因小鼠中，心脏局部NO水平增加，血浆ADMA水平降低，ADMA介导冠状动脉微血管的血管周围纤维化减轻。在异丙肾上腺素诱导的大鼠心力衰竭模型中，瑞舒伐他汀能显著降低ADMA水平，增加血清NO水平，从而缓解心肌细胞肥大、炎性细胞浸润、心肌间质纤维化等病理生理学和形态学改变[19]。综上所述，ADMA可诱导心肌纤维化。

囊性纤维化是一种常染色体隐性遗传病，可累及呼吸、消化和生殖等多系统，是欧洲和北美洲高加索人种中最常见的遗传性疾病之一。在囊性纤维化患者气道中，ADMA含量增加，NO减少，进而导致囊性纤维化患者气道阻塞。采用抗生素治疗囊性纤维化之后，ADMA水平显著下调，NO增加，肺部功能改善[20]，提示ADMA可能与囊性纤维化的发生与发展相关。

3 小结和展望

迄今为止，ADMA在纤维化发病中作用的研究尚属起步阶段。ADMA与纤维化的关系及作用机制尤其是与肺纤维化的关系仍有不少问题尚在探索之中。纤维化时，ADMA调控机制、细胞来源、ECM各种成分之间及其与细胞之间的相互关系等很多问题有待进一步研究。近年随着分子生物学进展，对DDAH和ADMA的分子结构与基因调控有了一定的了解，这为进一步深入研究ADMA在纤维化中的作用机制以及寻求纤维化治疗的药物靶点提供了更加合理的方法与途径。

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