慢生长黏液型铜绿假单胞菌的鉴定分析

徐新艳 赵水娣

铜绿假单胞菌是临床感染常见病原菌之一，也是支气管扩张、慢性阻塞性肺气肿、肺囊性纤维化等病变继发感染的主要病原菌[1]。随着抗生素的过度使用，导致临床标本中分离出的细菌菌落形态发生变异，给鉴定工作带来困难。现和大家共同探讨我院1例慢性阻塞性肺气肿患者的痰标本中分离的慢生长黏液型铜绿假单胞菌的检测。

1　材料与方法

1.1一般资料 患者，男，63岁，于多年前就无明显诱因出现咳嗽，咳少量白色泡沫样痰，并伴有胸闷气喘，呼吸困难，每年持续3个月以上。多次于我院就诊，诊断为：慢性阻塞性肺气肿、支气管扩张症。2017年1月因慢性阻塞性肺气肿急性发作入院。患者入院时体温、血压、心电图均正常。有“头孢菌素、青霉素、氨基酸”药物过敏史，无高血压病、糖尿病、心脏病等慢性病史。

1.2方法

1.2.1仪器 VITEK2-compact全自动微生物分析仪、VITEK MS快速细菌鉴定系统，法国生物梅里埃公司。DL-DYE-GR-16染色仪，珠海迪尔生物工程有限公司。

1.2.2试剂 GN卡、GN13卡，法国生物梅里埃公司。革兰氏染色液为珠海迪尔生物工程有限公司产品。药敏纸片、氧化酶纸片、噢普托欣纸片均为英国OXOID公司产品。血平板与巧克力平板为上海科玛嘉微生物技术有限公司产品。10%氢氧化钾、触酶试剂均为自配。药敏判断参照2017CLSI。

1.2.3质控菌株 质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923、铜绿假单胞菌ATCC27853、肺炎链球菌ATCC49619和粪肠球菌ATCC29212，均购自江苏英科新创医学科技有限公司。

1.3细菌培养与鉴定 根据标本采集要求留取痰标本，及时接种血平板和巧克力平板，同时涂片。痰直接涂片镜检结果是白细胞>25/LP，上皮细胞<10/LP，为合格痰，革兰染色主要见G-杆菌；痰培养24h结果血平板生长溶血小菌落，近似草绿色链球菌，巧克力平板未生长。48h血平板的小菌落长成大黏、不规则的水滴状，疑似黏液型肺链球菌，72h开始菌落又缩小，类似于自溶，巧克力平板仍然未生长。涂片革兰氏染色为G-杆菌；纯化分别转种血平板和巧克力平板，24h血平板见生长透明小菌落，巧克力平板未生长。再次涂片革兰氏染色为G-杆菌；考虑该菌生长缓慢，为了排除阳性菌，做了下列鉴定试验，结果分别为万古霉素药敏（R）、10%氢氧化钾拉丝试验（+），噢普托欣试验（-），氧化酶（+），触酶（+），而 VITEK2-compact（0.5麦氏单位）和质谱仪鉴定，均未出结果，KB法（0.5麦氏单位）药敏不生长；复传三代，第四和第五次传代的血平板上菌落生长状态渐好，巧克力平板从第四代开始缓慢生长。用第五次传代的菌在VITEK2-compact（0.5麦氏单位）进行生化鉴定，鉴定编码为0002041303500000铜绿假单胞菌，98%符合率。药敏仪器未检出结果，用KB法（0.5麦氏单位）测出对阿米卡星、头孢吡肟、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、头孢他啶、替卡西林、替卡西林/克拉维酸、氨曲南、美罗培南、头孢哌酮/舒巴坦、庆大霉素均敏感，左氧氟沙星、亚胺培南均耐药。

2　讨论

铜绿假单胞菌在血平板可形成五种菌落：典型菌落、大肠菌样型菌落、黏液性菌落、侏儒型菌落和粗糙型菌落[2]。菌落异常使同一菌株被误认为是不同的细菌，给细菌的鉴定带来困难。黏液型细菌的胞外多糖具有干扰正常宿主吞噬防御和促进生物膜形成的能力，与肺功能下降和预后差有关[3]，影响治疗效果。黏液性菌落变异型在囊性纤维化患者的呼吸道标本中很常见，与间歇性定植相关，黏液型细菌的出现也是慢性感染的一个标志[4]。

目前，针对不典型铜绿假单胞菌，尤其生长缓慢的黏液型铜绿假单胞菌，无较好的检测方法和手段，一是细菌生化鉴定仪：比较通用的有增加菌液浓度，但是并无可靠的文献支持；二是质谱：去除菌落表面的黏液，取基底部的细菌做质谱检测。这两种方法虽能鉴定出细菌，但药敏试验常因为不生长而无结果。有文献报道[5]，黏液型铜绿假单胞菌和非黏液型铜绿假单胞菌之间可以相互转变。将黏液型铜绿假单胞菌经传代的方式进行反祖，结果发现，经过反复传代后，较容易恢复为非黏液型铜绿假单胞菌利于鉴定和药敏试验。本案例慢生长黏液型铜绿假单胞菌最初用上述两种方法检测均未出结果，经过5次传代生长良好后用细菌生化鉴定仪鉴定出结果，药敏仍然未出结果，最终用KB（0.5麦氏单位）法测出药敏结果。最佳的传代次数还在试验中，有待继续探讨。

综上所述，我们认为在遇到细菌菌落不典型的情况下要参考痰涂片的结果，痰涂片革兰氏染色镜检能客观地反映细菌感染的真实情况，给痰培养提供一定的指导作用[6]，依据痰涂片结果在平板寻找相应的目标菌及时分离培养，针对该目标菌找出最合适的鉴定方法，及时检测出药敏试验结果，才能更好地服务于临床。

1赵德军，付维婵，胡照宇，等.慢性阻塞性肺疾病患者下呼吸道感染铜绿假单胞菌耐药性分析[J].中华医院感染学杂志，2011，21（11）：2340-2341

2张秀珍，朱德妹.临床微生物检验问与答[M].北京：人民卫生出版社，2014：146

3 Farrell PM，Collins J，Broderick LS，et al.Association between mucoid Pseudomonas infection and bronchiectasis in children with cystic fibrosis[J].Radiology，2009，252（2）：534-543

4詹姆斯H.约根生，迈克尔A.普法勒，主编，王辉.等译.临床微生物学手册[M].11版.北京：中华医学电子音像出版社，2017：984-988

5李瑜珍，曾学辉，李忠新，等.痰粘液型铜绿假单胞菌的分离及耐药性分析 [J].中华医院感染学杂志，2014，24（5）：1059-1060

6尚红，王毓三，申子瑜.全国临床检验操作规程[M].北京：人民卫生出版社，2014：636-638