肌肉生长抑制素基因的研究进展

杨 瑾，周播江

(遵义医学院 解剖学教研室，贵州 遵义 563099)

生长分化因子-8，也被称为肌肉生长抑制素(Myostatin，Mstn)，是转化生长因子β超家族的一员。Mstn基因是一种主要表达于肌肉组织的分泌蛋白,其主要功能是调节肌细胞的生长与分化，在哺乳动物生长发育过程中起关键作用。近来一直倍受研究者密切关注。

在动物体出生后，肌肉生长抑制素基因主要通过限制骨骼肌纤维数量和大小对骨骼肌生长发育起着重要的抑制作用[1]。因此，在许多哺乳动物和鱼类体内，该基因损伤或目的性抑制肌细胞生长抑制素蛋白可以引起肌肉大量增生的相应表型出现，并引起肌纤维类型发生变化。除了影响骨骼肌生长发育外，近年来还发现Mstn基因还参与糖类代谢，并对脂肪沉积起抑制作用[2-3]；在骨密度调控及雌性哺乳动物的生殖调控中，Mstn基因也起到一定作用[4-6]。本文主要对有关Mstn基因的结构特点、在动物体内的表达、作用机制、基因表达调控和信号转导等的方面相关研究进展进行综述，以便为骨骼肌纤维类型转换相关机制的研究提供资料。

1 Mstn基因的发现

Mstn，全称肌肉生长抑制素，于1997年由美国John Hopkins大学医学部研究人员McPherron等在研究转化因子-β(TGF-β)时通过聚合酶链式反应在小鼠骨骼肌中发现的新型生长因子[1]。McPherron在研究中发现Mstn基因缺失的小鼠肌肉增大，体重约是野生鼠的2倍[3]。研究显示，小鼠Mstn基因cDNA序列中只有一个开放阅读框架，共编码376个氨基酸。Mstn基因具有TGF-β共有的结构特性，但与家族其他成员的同源性很低，因而被归为新的一类并命名为生长/分化因子-8(Growth/differentiation factor-8，GDF-8)。同年，研究人员通过基因连锁，于mh轨迹中发现牛型Mstn，更好地证明了该基因可能是双肌型牛(double muscling，DM)产生的重要因素。随后的研究显示，比利时蓝牛Mstn编码区外显子缺失11bp碱基造成移码突变，从而导致自该碱基缺失后的第14个密码子起停止翻译，而皮埃蒙特牛同区域G-A错义突变也可导致双肌型牛的产生[7]。这种现象充分说明Mstn基因在骨骼肌生长发育中具有重要作用。大鼠、人、绵羊、狒狒等动物的Mstn也相继在后续研究中被研究并克隆[8]。其中，人的Mstn基因全长约7.7kb，含375个氨基酸，蛋白分子量为45-55ku，通常形成二聚体复合物[8]。

2 Mstn基因的基本结构

转化生长因子家族所有成员均含有三个明显不同的结构域：氨基端信号结构域、前肽结构域和C端成熟肽。作为TGF-β超家族中的一员，Mstn属于激活素/肌肉生长抑制素亚群，与其他成员的成熟结构域信号有约90%相同性[9]，都有以下显著特征：1、N端氨基酸有一个疏水核心；2、C端有RSRR保守性蛋白水解处理信号；3、C端结构域中有可促进“半胱氨酸结”结构形成的半胱氨酸残基。Mstn与其超家族其他成员之间的区别在于该基因C端氨基酸序列相对更短[10]。Mstn基因在不同物种内结构相似，有高度同源性，目前已研究的哺乳动物Mstn基因均含有3个外显子、2个内含子，除鼠类含有376个氨基酸残基，其余已被鉴定的哺乳动物均含有375个氨基酸残基[4]。

3 Mstn基因在组织中的分布

在哺乳动物中，Mstn基因主要在生长期和成熟期的骨骼肌中表达[8]。不仅骨骼肌细胞中发现Mstn基因，在其他组织中该基因也可发挥作用。最初的研究显示，牛和鼠的骨骼肌和脂肪组织中均发现Mstn基因表达。随后的研究表明，Mstn在哺乳动物乳腺上皮细胞、心脏浦肯野纤维及心肌细胞、脾脏组织、淋巴组织以及胎盘组织中，甚至人类子宫平滑肌和内膜细胞以及脑嗅觉系统的神经细胞中均有表达[4，11-13]。这些研究说明Mstn基因不仅可在骨骼肌细胞中存在，也可存在于哺乳动物其他组织中并发挥作用。研究还发现，Mstn基因在鱼类如罗非鱼、大马哈鱼等体内有更高的表达性，在骨骼肌、腮、肠、大脑、眼、性腺等组织中均可被检测到，且表达的时序性与肌形成顺序一致[6]。鸡的Mstn基因除存在于骨骼肌之外，在小肠、脾脏、脑等组织中也有少量表达[8]。

另外，在胎儿和成人心肌中，Mstn均有表达，且在失代偿性心衰患者及先天性心脏病患者心肌细胞中表达量显著增加[14]。肌组织局部缺血后，Mstn蛋白水平显著上升[15]，研究显示，在心脏主动脉收缩诱导性心肌肥大模型大鼠的体循环中Mstn水平也有所增加[16]。Mstn在心肌细胞细胞系内失活与心肌细胞肥大或心脏重量增加并无关系，在肌营养不良鼠模型中，该基因也不能降低心肌纤维化的发生，说明Mstn基因不能作为体内心肌纤维生长和再生的主要调节剂，从而说明该基因在心肌细胞和骨骼肌细胞中的作用方式不同[17]。

4 Mstn基因在骨骼肌中的表达

4.1 Mstn基因在哺乳动物骨骼肌中的表达 研究显示，在人类Mstn蛋白对培养的鼠类骨骼肌细胞系的抑制实验中，较之鼠类该基因的蛋白活性更低,提示在不同动物体内Mstn的表达产物具有高度保守性。Mstn在骨骼肌细胞中强烈表达，而Mstn缺如鼠中的肌肉量大量增加则表明肌肉生长抑制素蛋白对于骨骼肌细胞而言是一种肌肉特异性负调控因子[18]。牛、羊、狗等动物体内Mstn基因突变导致骨骼肌肌细胞数量增加表明该基因在哺乳动物体内均可表达其功能。Mstn也参与调节成年小鼠的肌群：通过注射中和抗体或拮抗剂可引起该基因抑制，从而导致健康的成年小鼠和肌营养不良的小鼠模型中骨骼肌质量增加[3]。因此，研究人员在研究肌萎缩疾病相关治疗中，对Mstn基因产生浓厚兴趣。

作为一个完整前体，被合成的肌肉生长抑制素蛋白可裂解成一个氨基末端肽和以分子活化形式存在的羧基末端成熟区域。在骨骼肌和血液循环中，肌肉生长抑制素是类似于其自身前肽、卵泡样抑素-3、潜在TGF-β结合蛋白等非活跃蛋白复合物的组分之一[19]。

Mstn基因缺失可诱导肌肉量增加，降低脂肪含量，抑制饮食引起的肥胖。Guo等[19]研究表明大鼠Mstn基因敲除可使肌肉量大量增加，与此同时葡萄糖利用率增加，胰岛素敏感性上升，脂肪含量下降，从而抑制肥胖。

王林嵩等[20]于2005年以EST片段为探针,运用Southern 杂交技术筛选相应文库，对兔Mstn基因进行cDNA克隆，得其全长为1269bp，编码375个氨基酸。由于实验所得兔cDNA克隆产物与人mRNA序列有高度同源性，达95%，推测啮齿类动物兔与人的Mstn基因组结构类似。因此，在研究人类骨骼肌Mstn作用的实验中，可应用兔作为动物实验阶段的材料。另外，家兔Mstn基因中含有多个蛋白激酶C、酪蛋白激酶、酪氨酸激酶磷酸化位点，提示该基因活性可受磷酸化和去磷酸化的调控。Mstn是骨胳肌生长发育过程中的负调节因子，已经引起生物医学界的广泛关注,研究该基因结构和功能对于阐明骨胳肌生长发育与再生的机理，及认识该基因在此过程中的作用至关重要。

4.2 Mstn基因表达在骨骼肌纤维类型转换中的作用 现有研究显示，一些信号通路在骨骼肌纤维类型转换中起重要作用，其中包括肌细胞增强因子-2、Mstn、肌纤维调节因子、胰岛素样生长因子、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARγ)、插头转录因子-1、促分裂原活化蛋白激酶等。在对关于过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α(PGC-1α)过表达的转基因猪的肌细胞纤维类型转换的研究中[21]，学者发现PGC-1α通过降低Mstn基因表达水平来调节猪体内肌纤维类型转换。在该项研究中，PGC-1α过表达，Mstn水平降低，伴随特异性肌纤维类型表达因子肌球蛋白重链基因(myosin heavy chain，MHC)中MHC I和MHC IIx显著上升，MHC IIa水平升高，MHC IIb水平下降。 Mstn基因主要通过肌组织内肌分化因子(MyoD)的转录活化来抑制肌细胞生长和发育[22-23]，在纤维类型转换过程中作用显著。

组织化学染色中不同肌纤维型的显色差异为分子生物学区别不同肌纤维型提供形态支撑。根据肌纤维ATP酶染色显示，与野生型鼠相比，Mstn敲除鼠的比目鱼肌中绝大多数为快肌II型肌纤维，而慢肌I型纤维水平较低。在对趾长伸肌进行活化琥珀酸脱氢酶染色得知，酵解型肌纤维占绝大多数，而氧化型肌纤维水平降低。纤维类型分布的差异伴随着MHC亚型表达水平的不同。与同窝仔畜野生型相比，在Mstn敲除鼠的比目鱼肌和趾长伸肌中，大量MHC II型，即快肌亚型表达，同时慢肌纤维类型减少。由此可得知，Mstn基因缺失，可导致快肌酵解型肌纤维大量增生。然而这一肌纤维表型很可能是发育过程的结果，而对成熟个体进行基因抑制并不会导致肌纤维类型向快肌酵解型转变[24]。因此，Mstn在肌细胞发育和分化过程中至关重要，且决定着肌纤维的表型发展。

4.3 Mstn基因抑制细胞生长的作用机制 为了验证Mstn基因具有抑制肌细胞生长的作用，研究人员检测了重组Mstn基因对小鼠骨骼肌细胞的影响，发现重组蛋白可抑制骨骼肌细胞增生及DNA和蛋白质的合成，从而抑制肌细胞生长[8]。随后的研究发现Mstn可以抑制细胞增殖相关的蛋白表达，上调细胞周期依赖性磷酸转移酶抑制因子，抑制成肌细胞从G1向S期转化[8]。

另外，Mstn可与多功能生长因子激活素受体结合，而高浓度的Mstn蛋白前体还可与卵泡抑制素结合，竞争抑制激活素的活性。部分学者认为Mstn可通过与卵泡抑制素相关基因结合形成复合物，竞争性抑制其活性，从而抑制肌肉生长[8]。内源性Mstn过表达可降低MyoD蛋白水平，诱导磷酸化发生改变，使MyoD在成肌细胞分化周期中的表达随之变化。细胞周期G1期MyoD表达水平最高，此时Mstn基因启动子活性较高，推测Mstn为MyoD下游靶基因，通过调节Mstn基因表达水平可调控成肌细胞细胞周期。

5 Mstn基因的功能

5.1 Mstn基因的信号传导 典型的TGF-β家族的信号传导由一系列Smad蛋白介导。分泌蛋白Mstn需要通过一系列级联反应将其信号传导至细胞核来发挥作用。 Mstn基因结合受体诱导受体调节性Smad(R-Smad)蛋白Smad2和Smad3的磷酸化和激活。随后，磷酸化的R-Smad蛋白与普通型Smad4集合，形成低聚体复合物，这种聚合物在细胞核内积聚，通过直接或间接与DNA结合来调控基因表达[8]。Mstn基因信号转录目标至今仍未完全明确。近期研究表明，Mstn基因可以调节MyoD表达，进而影响PPARγ，使其在细胞生成中发挥作用[25-26]。

C3H10T(1/2)细胞是一种胚胎源性间质母细胞，通过不同体外条件培养可以分化成多种细胞系，例如成肌细胞、脂肪细胞、软骨细胞等[10，27]，而Mstn基因可以抑制肌源性细胞分化潜能，促进间叶细胞向脂肪细胞分化。Rebbapragada等[28]研究发现，Mstn基因首先与II型丝氨酸/苏氨酸激酶受体结合，随后，激活素受体样激酶-4或激活素受体样激酶-5诱导Smad2或Smad3磷酸化从而促进C3H10T(1/2)细胞成脂分化。

5.2 Mstn基因表达的调控 在肌细胞内表达的 Mstn基因中的启动子和增强子都含有 E-box 结合序列，但序列不同[2]。启动子作为5’上游基因的一个重要调控因子，可以被转录因子约束从而参与基因表达的调控。对Mstn基因启动子的分析表明，Mstn可受控于多种转录因子。在猪的体内，Mstn启动子活化受肌细胞增强因子-2的调控[10]。而牛、羊体内，Mstn则受控于生肌决定因子-5、肌细胞增强因子-2及MyoD[9]。通过对猪Mstn基因启动子的研究，得知MyoD、PPARγ可正调控该基因，增强子结合蛋白-α、C/EBP-β则可对其进行负调控，而地塞米松可诱导Mstn生成[29]。

5.3 Mstn基因对肌细胞生长的影响 绝大部分Mstn表达于成熟或发育的肌肉组织中，可通过自分泌或旁分泌形式抑制成肌细胞增殖和分化，并参与糖类代谢和摄取的调控[4，30]。在小鼠体内目的性消除Mstn基因可导致成年鼠体内肌含量近双倍增长，其中肌纤维数量和大小均有所增加，且纤维表型向酵解型肌纤维类型转化[1，24]。Mstn缺失型动物体内肌细胞肥大增生的表现是否源于肌卫星细胞上肌肉生长抑制素所介导调控的抑制现象至今尚不明确。虽然部分研究显示肌肉生长抑制素抑制肌卫星细胞增殖，然而另一些研究则称这其中并无关系[31]。同样，一些学者在Mstn缺如的动物模型肌肉中发现大量增生的肌卫星细胞，而另一些人的研究中该细胞数量则显著减少。有关Mstn基因过表达或增补的研究显示，基因水平迅速增加可快速诱导肌萎缩，然而该基因水平缓慢提升则肌含量改善不显著。相反的，应用Mstn抑制性前肽对鼠进行治疗可诱导肌肥大[32]。Mstn可参与并激活TGF-β信号传导，激活MAPK等途径，抑制IGF-AKT和Wnt途径，各通路协同作用调控骨骼肌生长、分化，参与糖类代谢[4]。

5.4 Mstn基因也参与其他组织的调控 除了主要作用于骨骼肌生长和发育，Mstn基因还存在于胎儿和成体心脏组织中，参与调控心肌生长。而心脏器质性病变可引起Mstn在循环系统内浓度升高，抑制骨骼肌细胞的生长和分化，最终导致肌萎缩[4]。研究人员发现Mstn功能缺失型小鼠可以消耗更多的脂肪能量，脂肪含量减少，脂肪发生被抑制[33]。体外培养的原代前体黄色脂肪细胞向黄色脂肪细胞分化过程可被Mstn基因抑制，提示该基因可促进脂肪细胞能量储存[34]。另外，该基因还参与骨密度的调控，特别是在肌肉组织与骨组织粘连部位表现尤为明显，但研究表明在大龄小鼠体内注射Mstn抑制剂propeptide-Fc并不会增加骨密度和骨强度，只可使肌纤维增大，肌肉重量增加[35]，提示该基因在骨密度的调控机制中与年龄有关。而Hamrick等研究发现Mstn基因敲除鼠发生椎间盘退行性变的概率增加[36]，使得该基因在临床医学领域有了新的研究视角。Mstn还能够参与雌性哺乳动物的生殖调控，主要影响胎盘的建立和葡萄糖的摄入[4]。

6 展望

目前发现Mstn基因的功能涉及很多方面，与很多系统性疾病发生发展相关。随着研究的深入，Mstn基因有广阔的应用前景。例如，Mstn基因参与骨骼肌生长发育和纤维类型的转换机制可应用于运动医学，探究是否有相关作用靶点可以优化运动员肌肉耐力，也可应用于对肌营养不良性疾病如肌萎缩等的研究和治疗。心脏器质性病变患者如各种原因导致的心力衰竭或先天性心脏病等患者体内Mstn水平发生变化，对该机制及Mstn抑制剂的研究可预防性降低或延缓相关疾病发生进程。由于年龄、性别、健康状况等均可影响Mstn基因在各组织中的表达水平，故随着研究的深入，Mstn基因可在不同年龄、不同性别和不同健康状况的人群，对相关疾病预防和治疗发挥重要的指导作用。然而，有关Mstn基因与相关疾病的关系及其作用机制的还尚待阐明，而且该基因存在多态性，故Mstn基因的应用还需要更多后续研究。