肺癌肿瘤干细胞耐药机制的研究进展

李 彤，董 明，陈 军 （天津医科大学总医院肺部肿瘤外科，天津300052）

0 引言

肺癌是对人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一，在美国，肺癌的发病率在男性和女性中均居第二位，而死亡率则均高居第一位。而在我国，肺癌每年发病人数约78万，肺癌在男性中的发病率和死亡率均位于第一，女性中发病率位于第二，死亡率位于第一。肺癌主要包括两种病理类型，即非小细胞肺癌（non⁃small cell lung cancer， NSCLC）和小细胞肺癌（small cell lung cancer， SCLC），NSCLC 又可以进一步分为腺癌、鳞状细胞癌及大细胞肺癌［1］。近年来，随着医学和科学技术的发展，对于肺癌的治疗也取得了一些进展。目前肺癌的治疗方式主要包括手术、化疗、放疗、靶向治疗和免疫治疗等，然而肺癌患者的5年生存率仍相对较低，其主要原因可能是因为患者在治疗过程中对放化疗等常规治疗手段产生耐药或抵抗。目前医学上常通过应用新药、单独或联合使用化疗及放疗等方案解决耐药的问题，然而耐药的具体产生机制仍有待研究。

目前越来越多的学者认为，肺癌治疗中耐药的产生可能是由于肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSC）的存在。CSC不同于一般的肿瘤细胞，它具有自我更新和分化的能力，其在肿瘤形成、进展、转移以及耐药等方面都起着重要的作用。CSC可以通过不对称分裂拥有自我更新和分化成其他细胞的能力，除此之外，其还可以通过对称分裂获得膨胀发展的能力。有研究［2］显示，单纯的CSC细胞可以呈现两种分裂方式，可形成大量增殖的CSC以及非CSC的肿瘤细胞，而单纯的非CSC细胞培养仅呈现对称分裂的分裂形式。此外，化疗等细胞应激条件可以促使CSC对称性分裂而大量增殖，这种效应在化疗的过程中不断放大，最终形成化疗耐药的肿瘤。Liu等［3］的研究显示在裸鼠的肺癌模型中，接受铂类的治疗后，肺CSC的比例显著增加。

常规的化疗方案可以杀死大量的肿瘤细胞，但是CSC可以通过多种方式导致化疗耐药。首先，CSC细胞可以通过增强DNA损伤应答反应从而修复化疗导致的DNA损伤。以铂类为基础的化疗方案主要通过与肿瘤细胞的DNA相互作用，形成链内及链间的交联，从而破坏染色体的结构并影响细胞分裂，但与此同时细胞内还会激活DNA损伤修复应答反应的信号网络。对于化疗敏感性的肿瘤细胞，DNA损伤的程度远远超过了细胞的修复能力，因而出现细胞凋亡；然而CSC可以增强对DNA损伤识别和修复的能力，从而使其存活，产生化疗抗性［4］。 近期的研究［5］显示，与DNA损伤修复相关基因的过表达也与CSC的化疗抗性程度显著相关。此外，化疗药物导致DNA损伤从而进一步诱导细胞凋亡，而CSC则可以通过启动抗凋亡机制增加细胞的存活。有研究［6－7］发现，抗凋亡蛋白Bcl⁃2在CSC中高表达，并且其在调节CSC的化疗抵抗中起着重要的作用。CSC还可以通过多药耐药性外排泵促进肿瘤细胞将化疗药物转运出细胞，降低细胞内的药物含量从而导致化疗抗性。ATP 结合的转运蛋白（ATP⁃binding cassette， ABC）家族是最具特征性的多药耐药性蛋白之一，研究［8］发现ABC转运蛋白的表达量与多种肿瘤（NSCLC、乳腺癌、卵巢癌等）CSC的化疗抗性显著相关。

总之，肺癌中CSC的存在使得肿瘤细胞对于常规化疗、放疗等方案产生耐药，因此，针对CSC的靶向药物对于化疗耐药的治疗、抑制肿瘤的进展及复发显得尤为重要。目前关于肺癌CSC导致化疗耐药的内在机制还不是很明确，但是肺癌CSC的很多标志物已经被证实，其中包括乙醛脱氢酶⁃1（aldehyde de⁃hydrogenase⁃1， ALDH1 ）、 CD133， CD166、 CD87 和CD117等，这些标志物的存在均与肺癌的治疗抵抗密切相关。

1 ALDH家族与肿瘤耐药

ALDH家族是可以将细胞内的乙醛氧化成乙酸的酶类物质，其在正常的造血干细胞中高表达，除此之外，其已经成为多种恶性肿瘤CSC的表面标志物［9］。ALDH1阳性的细胞其干性特征显著增强，表现为增殖能力、自我更新及分化能力的增强和对化疗药物的抵抗程度增强等特征。将低剂量的ALDH1阳性的肿瘤细胞注射至裸鼠体内，可以促进肿瘤的发生发展，但是ALDH阴性的肿瘤细胞并没有这种能力［10－11］。ALDH阳性的肺癌细胞系增殖能力显著升高，并且可以产生ALDH阳性与阴性的混杂细胞群，而ALDH阴性的细胞只能继续分裂成ALDH阴性的细胞群，这就说明ALDH阳性的细胞具有自我更新和分化的能力。在NSCLC患者中，ALDH在肿瘤组织的表达量要显著高于癌旁组织［12］。一项针对1926例肺癌患者的荟萃分析［13］显示，ALDH1高表达的患者，其总生存期和无病生存期均显著下降。Notch通路是细胞内一条重要的信息传导通路，研究［14］显示，该通路参与维持ALDH1阳性肺癌CSC的干细胞特性。应用γ⁃分泌酶抑制剂抑制Notch通路后，ALDH1阳性的细胞数量显著减少，并且肿瘤细胞的增殖能力大大减弱。ALDH1高表达后，CSC和EMT的标志物均明显增加，对于铂类药物的耐药程度也大大增加［15］。

化疗可以诱导ALDH1阳性的CSC产生增多。肺癌细胞系经紫杉醇治疗后，ALDH1阳性的CSC细胞数量大大增加。肺癌动物模型实验［16］中，单用紫杉醇治疗后，虽然肿瘤大小有所缩小，但是转移灶增多，并且ALDH1阳性的CSC数目也有所增加。与此同时，增多的ALDH1阳性肿瘤细胞对多种化疗药物的耐药程度显著增加，如铂类、吉西他滨、阿霉素、柔红霉素、多西他赛等［15］。 一项最近的研究［17］显示，使用靶向ALDH1的药物二乙氨基苯甲醛和双硫仑后，可以使顺铂耐药的肺癌细胞系重新恢复对顺铂的敏感性。除此之外，放疗也可诱导ALDH1阳性的CSC增加，重复的4Gy放射治疗可诱导耐药性A549细胞系的产生，表现出大量的ALDH1阳性细胞的增加，肿瘤的增殖能力以及对治疗的耐药程度大大增加［16］。

2 侧群（side population，SP）细胞与肿瘤耐药

研究者应用流式细胞术在肿瘤细胞中分选出了一批Hoechst 33342染色阴性的细胞群，其具有干细胞特性，大部分的肿瘤细胞可以保留住 Hoechst 33342染料，而该细胞群将该染料完全转运出细胞外，呈现出Hoechst 33342染色阴性，这些细胞称为SP细胞［18］。SP细胞可展现出增殖能力、自我更新和分化能力的增强等干性特征。SP细胞表面高表达ABC 转运蛋白，如 ABCG2、MDR1、ABCA2等，在这类转运蛋白的作用下，肿瘤细胞可以将化疗药物转运出细胞，从而降低细胞内药物浓度，导致化疗抵抗。通过分析六种 NSCLC 细胞（H460、H23、HTB⁃58、H441、H2170和A549）的SP细胞比例发现，SP细胞占总细胞数的比例为1．5%～6．1%，并且SP细胞亚群展现出ABCG2的高表达，以及较强的增殖潜能和致瘤性，在应用ABCG2抑制剂维拉帕米处理后，SP细胞的数量则大大减少［19］。

Yang等［20］从A549肺癌细胞系中分离出SP细胞，发现其干细胞标志物的表达量与非SP细胞相比显著升高，克隆形成能力及对顺铂的抵抗程度显著增强；但是SP细胞中自噬小体的表达显著降低，在顺铂治疗后，其表达量则有明显增加，通过抑制SP细胞的自噬则可以增强铂类药物的治疗效果。由于SP细胞的药物泵出作用使SP细胞存在的肿瘤对于多种治疗均产生耐药，因此针对这种泵出效应的治疗是目前研究的一种治疗方法。Pelitinib是一种不可逆的表皮生长因子受体（epidermal growth factor recep⁃tor，EGFR）抑制剂，其已用于治疗肺癌的临床试验中。有研究［21］发现Pelitinib可以竞争性抑制ABCB1和ABCG2，可以浓度依赖性的方式显著抑制ABCB1和ABCG2介导的药物外排，从而增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。除此之外，近期的一项研究［22］显示对铂类化疗产生耐药的NSCLC患者表现出较高的胆固醇含量和ABCG2的表达。体外模型研究［22］证实，胆固醇可以增加肺癌细胞对于治疗的耐药程度，而ABCG抑制剂尼卡地平可以治疗由胆固醇所致的化疗耐药。同样，用他汀类药物联合化疗也可以增加肿瘤对于化疗的敏感性。

吸烟是肺癌患者预后不良的危险因素，研究［23］显示吸烟可以通过增加SP细胞的数量来增加肿瘤的耐药程度。当用香烟烟雾冷凝液处理A549肺癌细胞系后发现，SP细胞的数量增加，ABCG2的表达提高，并且多柔比星的流出量也大大增加，这一效应则是通过PI3K／Akt通路介导的，因此使用PI3K／Akt通路抑制剂可以通过抑制该通路增加细胞内多柔比星的含量使得肿瘤细胞对于化疗药物再次敏感［24］。

3 CD133与肿瘤耐药

CD133是由prom基因编码的120 kD大小的跨膜蛋白，其在未分化的细胞（造血干细胞、内皮祖细胞、神经干细胞）和包括肺癌在内的大多数肿瘤细胞中表达水平较高［25－26］，是最常用的细胞表面抗原，用于检测和分离各种实体瘤的CSC，包括脑、结肠、胰腺、前列腺、肺和肝脏。然而，最近有研究［27］表明，使用CD133作为CSC检测和分离标记物的准确性。CD133已被假定为鉴定多种实体肿瘤类型中的CSC群体，包括几种形式的脑癌、前列腺癌、结肠癌、肺癌、肝细胞癌和卵巢癌，其中前3种癌症研究最多。研究［28］表明，表达CD133的CSC在移植入免疫缺陷小鼠后表现出自我更新潜力和再生组织学上相似的肿瘤块的能力。一篇针对11项研究的meta分析［29］纳入了1004例NSCLC患者的组织标本，证实较高的CD133表达预示着患者较差的5年生存率，并且与患者的肿瘤分期、分化、淋巴转移情况均密切相关。

在耐药方面，肺癌中CD133阳性CSC的存在增加了ABC转运蛋白ABCG2的表达，从而导致肺癌对于铂类、吉他西滨、紫杉醇等一线药物的耐药。研究［3］显示，低剂量的铂类治疗可以导致DNA的损伤而不是细胞死亡，可以诱导ABCG2的表达上调，进一步导致CD133阳性细胞增多。用特异性的ABCG2抑制剂泮托拉唑或ABC转运蛋白抑制剂维拉帕米可以降低肿瘤对于铂类的耐药程度［3］。另一方面，缺氧状态在多种实体肿瘤均存在，近期的研究［30］证实，缺氧状态可以诱导CD133阳性和Oct4过表达的细胞产生，从而导致肿瘤对吉非替尼的耐药，并且吉非替尼耐药细胞的产生与HIF⁃1α和胰岛素样生长因子受体的表达相关，抑制HIF⁃1α和胰岛素样生长因子受体的表达可以减少CD133阳性的细胞数，缓解吉非替尼的耐药。

4 CD166与肿瘤耐药

CD166也称之为活化的白细胞粘附分子，是一种膜糖蛋白，可表达于间充质干细胞和造血干细胞表面。其可以介导白细胞的外渗、T细胞的活化和增殖。除此之外，CD166的高表达与多种恶性肿瘤的不良预后显著相关，近年来也被认为是肺癌CSC的标志物之一。研究［31］发现，CD166阳性的NSCLC细胞体内的成瘤能力以及体外的成球能力均显著高于CD166阴性的细胞群，并且CD166的表达与甘氨酸脱羧酶（glycine decarboxylase，GLDC）、干细胞因子Lin28B显著相关，下调GLDC和Lin28B后，细胞的增殖和呈瘤能力显著下降；较高的 GLDC表达以及CD166阳性也预示着 NSCLC患者的不良预后。CD166也与肺癌的化疗抵抗密切相关。研究［32］发现化学缺氧可以导致肺癌细胞的干性增强以及对化疗的敏感性降低，其中CD166阳性的细胞群对化疗的抵抗程度要显著高于CD166阴性的细胞群。SLC27A2是一类可以将长链脂肪酸转运至细胞内的跨膜蛋白，Su等［33］研究发现 SLC27A2在 CD166阳性的肺癌细胞群中低表达，并且其低表达可以通过负性调节Bmi1⁃ABCG2信号从而增强肿瘤细胞的化疗抵抗，体内及体外实验均证实上调SLC27A2的表达后，CD166阳性的肺癌细胞对化疗的敏感性显著增加。

5 CD117与肿瘤耐药

CD117是一种III型受体酪氨酸激酶，通过与其配体——干细胞因子结合来调节细胞增殖、凋亡和粘附。最近的研究［34］发现CD117在各种人类恶性肿瘤中异常过表达，并且它可能在致癌和转移中起到关键作用。在肺腺癌中，干细胞因子和CD117的过表达与患者的预后不良、低生存率和化疗耐药密切相关。癌症中CD117的激活可导致许多下游信号传导途径的激活，例如 RAS／ERK、PI3⁃激酶、SRC、JAK／STAT、WNT和NOTCH，并且已知这些途径的激活诱导“干性”或茎样表型。例如，活化的酪氨酸激酶SRC与急性髓细胞白血病（acute myeloid leukemia，AML）细胞中Akt⁃mTOR相互作用，从而增强了AML细胞的干性［35］。NSCLC细胞系在CSC选择性培养基中形成肿瘤球，其CD117的表达升高对化疗的耐药能力增加。

6 CD87与肿瘤耐药

大多数的实体肿瘤表现出尿激酶纤维蛋白溶酶原激活剂（uPA）和其受体（uPAR）表达的升高，该受体也称之为CD87。uPA及其受体CD87水平升高与许多肿瘤患者的预后不良密切相关。CD87有助于控制膜相关的细胞外蛋白水解和跨膜信号传导，从而影响细胞在生理和病理条件下的迁移和侵袭［36－37］。恶性细胞中的CD87过表达是由几种致癌途径的激活引起的，包括MAPK、RTK、ERK2和 FAK。 在 NSCLC和其他肿瘤的小鼠模型中，抑制CD87可以抑制肿瘤生长、侵袭、血管生成和转移［38］。CD87水平升高与鳞状细胞癌和NSCLC患者的死亡率升高相关［39］。Gutova等［40］从SCLC细胞系中分离出了CD87阳性的细胞系，证实了其高表达CSC的标志物，并且具有干细胞特性。CD87阳性的细胞可以增加肿瘤的分化潜能，增加肿瘤对于传统化疗药物（铂类、依托泊苷、紫杉酚）的耐药程度。

一线化疗方案联合特异性靶向CSC的药物可以作为治疗肿瘤化疗耐药、复发和转移的有效方案，然而目前针对肺癌干细胞的药物还没有广泛应用于临床。CSC标志物的抑制剂，比如ABCG2抑制剂可以显著提高CSC对于化疗药物的敏感性。阿西替尼是一种靶向酪氨酸激酶的小分子口服药物，它可以抑制CD117和ABCG2的表达，体内和体外实验［41］均证实，其可以改善肿瘤对于化疗药物的多重耐药。阿西替尼和多柔比星的联合治疗可以增加SP细胞内多柔比星的细胞内含量，并且增强多柔比星的细胞毒作用。此外，有研究［42］通过抑制 ALDH1在 CSC中的表达缓解肿瘤化疗的耐药程度。传统的化疗方案对于恶性胸膜间皮瘤疗效甚微，应用ALDH1抑制剂（二乙基氨基苯）可以增加肿瘤对于铂类化疗的敏感性，在A549和H522肺癌细胞系中，沉默ALDH1A1的表达或者应用ALDH1抑制剂也可以显著减少细胞的增殖能力和迁移能力［42］。 除此之外，有研究［43］发现了另一种ALDH1的抑制剂双硫仑，既往通常将双硫仑用于慢性酒精中毒的治疗，而双硫仑可以特异性抑制CSC的ALDH1的表达，从而增加铂类的细胞毒性，增强肿瘤对于放疗、化疗的敏感性。一项针对转移性NSCLC患者的临床试验［44］证实，双硫仑联合铂类或者长春瑞滨的治疗表现出良好的患者耐受性，并且可以显著提高患者的总生存率。

7 结论与展望

尽管目前靶向药物治疗不断发展，但是其对于改善肺癌患者预后的效果并不明显。CSC在肿瘤的治疗耐药中起着重要的作用。针对干细胞信号通路的药物可以缓解肿瘤的耐药程度，预防肿瘤的复发，延缓肿瘤的进展并提高患者的生存率。但是目前针对CSC的药物尚未大规模应用于临床，大部分还处于临床前研究和临床试验阶段，相信在不久的将来，CSC的靶向药可以广泛应用于临床，有效缓解肺癌患者对于传统治疗方案的耐药，为肿瘤患者的治疗提供新策略和新方法。