同型半胱氨酸致出生缺陷的机制研究进展

黄青青 钱燕 王丹

出生缺陷是指胚胎或胎儿在发育过程中发生解剖学和/或功能上的异常[1]。出生缺陷发病机制复杂，遗传和/或环境因素交互影响参与其发生[2]。近年来国内外研究报道都证实了同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）与先天性心脏病（congenital heart disease，CHD）、神经管畸形（neural tube defects，NTDs）和唇裂等多种出生缺陷的发生密切相关[3-5]。鉴于出生缺陷发生率逐年增加，探寻Hcy诱发出生缺陷的分子机制至关重要。因此，本文就Hcy导致出生缺陷的分子机制作一综述。

1 H cy与血流动力学改变

胎盘及胚胎内脏器稳定的血流动力学是维持胚胎生存及发育的基础。研究显示，发育早期的鸡胚注射低浓度Hcy后，在胚龄3.5d（相当于人胚胎5～8周）时，鸡胚左、右心室射血分数，峰流速及流出道收缩时间均显著下降，而流出道舒张时间延长；同时，Hcy组鸡胚心率明显低于对照组。而此时B超却未发现明显的形态学异常，提示Hcy能够直接诱发胚胎重要脏器血流动力学紊乱，而且这种改变早于形态学畸形的发生[6]。另有研究通过静脉夹闭实验验证了上述结果，即通过夹闭发育早期（胚龄4d）鸡胚的对横向卵黄静脉5h，心脏内血流动力学参数发生急剧下降，鸡胚心脏后期出现明显的流出道畸形，特别是室间隔缺损、瓣膜异常和咽部主动脉畸形，且畸形与Hcy处理导致的畸形类似[7]。以上证据提示，Hcy能通过引起血流动力学紊乱，从而诱发多种类型的CHD。

有研究报道，给予鸡胚50、75和100mM的Hcy处理72h后发现，胎盘血管密度分别减少50.3%、70.6%和74.0%，同时，鸡胚存活率下降32%、50%和66%[8]。说明Hcy可能通过抑制血管生成削弱胚胎存活力。随着Hcy病理机制的深入研究，Latacha等[8]发现Hcy可以从基因和蛋白水平抑制血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表达。VEGF是关键的血管生成调控因子，其表达的下降会导致胎盘/胚胎血管生成受抑，组织血流重新分布，间接加剧了胚胎血流动力学的紊乱。另外，Hcy作用后，心脏局部组织中内皮素-1（endothelin-1，ET-1）表达下降，内皮型一氧化氮合酶-3（endothelial nitric oxide synthase-3，eNOS-3）表达增加，这两者作用相互制衡[9]。ET-1作为另一种血管生长因子，负责血管收缩的调控；eNOS-3介导一氧化氮的合成，并负责血管舒张。在血流正常的心脏中，eNOS-3通常表达于高剪应力的组织中，如房室管和流出道；而ET-1往往在低剪应力的组织中呈高表达。随着胎盘/胚胎血管分布及其血流动力学的改变，胚胎脏器内部血流供应减少，血管剪应力也随之降低[7]，继而导致ET-1和eNOS-3表达及分布异常，最终引起脏器发育不平衡[6，9]。

以上证据提示Hcy可通过改变胎盘及发育早期胚胎脏器的血流动力学参数，引起脏器时空发育紊乱，从而导致脏器的形态学畸形。

2 H cy与D N A损伤

研究发现，当体内Hcy水平过高时，机体需要更多的叶酸来代谢过多的Hcy[10]；增加叶酸摄入可改善高同型半胱氨酸血症（hyperhomocysteinemia，HHcy），两者水平呈负相关；提示HHcy会导致叶酸相对不足。有报道认为，体内叶酸不足时，胸腺嘧啶合成障碍，尿嘧啶（dUMP）被错误地掺入DNA链中，机体将启动以下两种反应：（1）如果在互补DNA双链上同时掺入dUMP，后者会被损伤修复系统识别并切除，导致DNA双链断裂，进而诱发染色体离断；（2）若dUMP未被切除，则会在DNA复制过程中会产生G-C替换，引起点突变。表明HHcy可以通过引起叶酸“相对不足”，诱发DNA损伤。

Hcy还能直接诱发DNA损伤。Ye等[11]体外分离培养海马神经元并予以0.25mM Hcy处理4h，碱性彗星试验（检测DNA链断裂）检测发现70%的神经元细胞核呈现损伤的阳性拖尾，而对照组阳性细胞核只占8%，提示Hcy可造成细胞DNA链断裂。研究发现亚甲基四氢叶酸还原酶（methylene tetrahydrofolate reductase，MTHFR）发生C667T或A1298C突变者，血浆Hcy水平升高。MTFHR C667T TT基因型者和C667T CT或C667T CC基因型者相比，血浆Hcy水平升高更为明显；同时，C667T TT基因型者细胞DNA损伤程度也较C667T CC或C667T CT基因型者更为严重。提示Hcy能够直接诱发DNA损伤，且呈浓度依赖性。不仅如此，Fenech[12]收集不同年龄健康人的淋巴细胞发现，血浆Hcy浓度与染色体微核（染色体异常表现之一）形成呈正相关；而通过叶酸降低Hcy水平，能够缓解染色体微核的形成。另有研究显示，HHcy可导致人类21号染色体发生异常，从而增加Down’s综合征的发生风险。说明Hcy不仅损伤DNA，还可造成染色体异常，影响人类基因组的稳定性[12]。

以上研究提示饮食和/或遗传因素造成的高水平Hcy都可以诱发DNA损伤，甚至染色体异常。

3 H cy与D N A甲基化

Song等[13]检测21-三体综合征患儿血Hcy和单核细胞甲基化水平，并与年龄相匹配的正常儿童相比后发现，21-三体综合征患儿血浆Hcy水平升高，细胞DNA甲基化程度下降[14]。这一证据提示，高水平Hcy引发的低DNA甲基化参与21-三体综合征的发生。

国外学者收集因CHD和/或21-三体综合征终止妊娠的患儿心脏和正常人的血液标本，观察了分布于407个基因上的465个CpG岛的甲基化程度，发现CHD和21-三体综合征胎儿的心肌基因组甲基化程度均显著低于正常对照组[15]。同时，Chowdhury等[16]的前瞻性研究发现，与生育正常子代的母亲相比，母亲生育无症状CHD者，其基因组中大部分CpG岛的甲基化程度下降；同时，作者还鉴定出丝裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路相关基因MAP4K5和MAPK13为甲基化差异基因。MAPK通路通过调控细胞增殖、分化和迁移参与多种疾病的发生、发展[17-18]。以上证据提示，MAPK通路相关基因的异常甲基化参与了CHD的发生。此外，小鼠透明质酸合酶2（hyaluronan synthase 2,Has2）基因是心内膜发育和瓣膜形成的必需基因。在正常胎鼠妊娠14.5d时（瓣膜发育期），Has2基因表达下调并伴有甲基化增加。如果Has2基因持续高甲基化状态，将引起流出道细胞过度增殖，从而导致心脏流出道狭窄[19]。因此，DNA甲基化还通过调控靶基因的时空表达参与心脏的正常发育。

异常DNA甲基化还参与NTDs的发生。在小鼠NTDs模型中，全基因组DNA甲基化于胚胎妊娠3.5d开始增加，妊娠6.5d达高峰，整个孕期均维持高甲基化状态。NTDs小鼠Siah1b和Prkx基因的甲基化程度减少，随之伴有上述基因表达的增加。据报道，Siah1b可被p53活化，诱导细胞周期阻滞或凋亡[20]；Prkx基因编码丝氨酸酪氨酸激酶，调控神经元增殖、分化和迁移[21]。叶酸是公认的甲基供体前体，经叶酸治疗后小鼠Siah1b和Prkx基因甲基化增多且表达减少，NTDs发生率也明显下降[22]。

研究发现，Hcy是全基因组DNA甲基化程度的重要调控因子[23-24]。Dominquez-Salas等[25]发现，母亲孕期血浆Hcy水平增高，子代来自于中胚层的单核细胞和来自于外胚层的毛发的DNA甲基化均减少；也就是说，母亲血浆Hcy水平和子代DNA甲基化程度呈反比。因此，胚胎在基因印迹过程中暴露于高水平Hcy环境，甲基供体不足和DNA甲基化异常，最终诱发多种出生缺陷。

4 H cy与细胞凋亡

胚胎发育过程中，细胞凋亡失常会干扰组织、器官形态建立和功能发挥，从而导致畸形发生。1996年，Rosenquist等[26]首次发现 Hcy能诱发 NTDs，Hcy浓度为 0.5～2.5、5～7.5、10 和 15μM 时，NTDs发生率分别为0%～5%、≤18%、≥30%和≥75%；不仅如此，NTDs发生部位还检测到明显的神经细胞凋亡[27]。另外，研究表明，Hcy也可诱导鸡胚心脏神经嵴细胞凋亡，继而导致心脏流出道心肌化减少、流出道垫体积增大和室间隔缺损[28]。以上证据提示，Hcy能够通过细胞凋亡诱发多种出生缺陷。

Hcy致细胞凋亡的机制如下：（1）氧化损伤：Hcy侧链上的巯基发生自氧化反应的过程中，产生大量的H2O2、OH-和超氧阴离子（）等活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）。ROS启动脂质过氧化反应，破坏细胞膜性结构的完整性，诱导细胞凋亡、甚至死亡。在大鼠实验中，当脑组织和海马神经祖细胞暴露于高浓度Hcy环境时，MAPK信号通路被活化，活化的MAPK通路抑制下游凋亡因子B淋巴细胞瘤-2基因表达，神经细胞大量凋亡，最终表现为宫内生长迟滞和脑容量减少[29]。（2）内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）：由于各种原因引起的内质网中堆积错误折叠/未折叠蛋白或Ca2+平衡紊乱的状态，即为ERS。剧烈或长程的ERS会激活凋亡程序以除去严重受损的细胞。Zhang等[30]研究认为，Hcy诱导脐静脉内皮细胞死亡，是通过未折叠蛋白聚集引起ERS，而非氧化损伤。蛋白质结构改变，蛋白折叠和分泌受影响，内质网中错误折叠蛋白积聚引起ERS，最终诱导细胞凋亡。

综上所述，Hcy致出生缺陷机制复杂，可能是多种机制共同作用的结果，仍有待前瞻性流行病学调查和进一步的体内外研究。但目前大量研究均表明Hcy与出生缺陷密切相关，这提示监测孕母Hcy水平并予以干预，可早期预防出生缺陷的发生。