葡萄酒中高分子聚合多酚的研究进展

索昊，田若晨，张舒婷，孙宝山*

（1. 沈阳药科大学药学院，辽宁沈阳 110016；2. 沈阳药科大学中药学院，辽宁沈阳 110016；3. 沈阳药科大学功能食品与葡萄酒学院，辽宁沈阳 110016）

多酚类物质是葡萄酒的重要的组成成分，由于其不仅对葡萄酒的感官特性有着决定性的作用，更是影响葡萄酒生物活性的重要化合物，因此近些年来引起了科学界的广泛关注。研究表明，葡萄酒中高分子聚合多酚是葡萄酒多酚的主要存在形式，由于其分子量大并且结构复杂，难以进行分析，因此对其研究报道并不多见，已有研究报道多集中于葡萄酒多酚中的小分子酚类物质、聚合原花青素与聚合色素。近些年来，随着科学技术的发展，对高分子聚合多酚的研究取得了一定的进展，因此高分子聚合多酚的结构分析及生物活性研究逐渐成为了葡萄酒研究者的工作重点。本文综述了国内外关于葡萄酒中高分子聚合多酚的形成过程、含量测定、结构组成、生理活性等研究报道，为高分子聚合多酚今后的研究提供参考。

1 高分子聚合多酚的含量及形成

葡萄多酚包括原花青素类（单倍体、低聚体、高聚体）、花色苷类、酚酸、白藜芦醇及其衍生物、黄酮醇、黄烷醇及黄酮类化合物。葡萄酒多酚不仅包括来自葡萄本身的多酚类物质，而且也包括一些在酿酒过程中形成的新型酚类化合物，并且在酿酒的初期阶段，某些酚类化合物的酶促或非酶促反应开始发生，这一反应过程在葡萄酒的发酵和陈酿过程中会持续存在，这些化学反应使葡萄酒多酚的结构组成更加复杂，形成了结构多样的高分子聚合多酚。红酒中高分子聚合多酚主要由高聚原花青素、花色苷-原花青素聚合物（直接缩合，间接缩合）、聚合色素，小分子酚酸等各类物质组成[1-3]。高聚原花青素是高分子聚合多酚的一部分，其本身的聚合程度高，可以由几十个单倍体聚合而成，由于花色苷也可以与原花青素聚合，这更增加了高分子聚合多酚的聚合程度，同时也增加了高分子聚合多酚的分子量。

以酒龄一年的葡萄牙产的干红葡萄酒为例，从定量分析的角度看，儿茶素类化合物约占多酚总量的5%～8%，原花青素二聚体占5%～10%，花色苷类占10%～15%，酚酸类成分占3%～6%，黄酮醇类成分的含量少于1%，白藜芦醇一直是人们关注的热点，其含量仅占多酚的0.3%左右，然而高分子聚合多酚的含量高达80%左右。这一研究结果表明，高分子聚合多酚是葡萄酒多酚最主要的存在形式[4]。

2 高分子聚合多酚的分离与结构分析

孙宝山等[5]在1994年首次采用C18固相萃取小柱，实现了葡萄酒中高分子聚合多酚的提取分离。2006年，孙宝山等[6]采用“组合分段法”，根据物质极性大小，以甲醇为洗脱剂，获得高分子聚合多酚组分，并成功的将原花青素（寡聚、多聚）从聚合色素物质中分离出来，并对各组分的化学结构进行了初步分析验证。2013年，Wollmann等[7]采用超滤法也从红葡萄酒中分离得到了分子量大于5 kDa的高分子聚合多酚。

化学降解法是一种常见的分析前处理技术手段，其目的在于将大分子化合物降解为小分子化合物，通过对小分子化合物的结构分析，进而推测大分子的结构组成。以化学降解法分析多聚原花青素的结构为例，目前的降解方法主要有酸催化降解、金属催化降解、碱催化降解、微生物降解[8-11]。酸催化降解反应是比较简单常用的方法。在酸和亲核试剂同时存在的条件下，原花青素的黄烷-3-醇结构单元之间的连接键断裂，释放末端的结构单元，同时单元中C4位形成的碳正离子被适当的亲核试剂进攻，形成亲核附加衍生物。孙宝山等[12]采用苄硫醇作为亲核试剂降解原花青素，此方法可应用于原花青素平均聚合度的检测。张舒婷等[13]用无色无味的间苯三酚代替苄硫醇作为亲核试剂对原花青素进行降解，更加安全，有更广泛的应用。Torres等[14-15]以巯基乙胺为降解试剂，对白葡萄皮渣中的聚合原花青素进行降解，得到新型半胱胺-黄烷醇结合物，经研究表明这些降解结合产物具有保护神经细胞的功能。罗兰馨等[16]使用亚硫酸将葡萄籽和葡萄皮中的聚合原花青素降解成为寡聚以及单倍体原花青素。崔璨等[17]利用卡托普利为降解试剂在酸催化的条件下，以葡萄籽粗提物为对象，分析了葡萄籽提取物中高聚原花青素的组成，并发现卡托普利-黄烷醇的结合物可作为潜在的抗高血压的前药。Jiang等[18]采用Pd／C为催化剂氢化降解兴安落叶松中的原花青素，降解率可达到为67.5%。White等[19]报道在碱性水解条件下解聚蔓越莓果渣中的高聚原花青素，短时间内，随着温度的增高，降解成低分子量的原花青素产率增加，但降解后的低聚原花青素成分复杂，难以分离得到。微生物降解原花青素是一个复杂的过程，王恒永等[20]在真菌降解沙棘原花青素的研究中，筛选出了可对沙棘原花青素进行降解的菌种，结果表明该菌对原花青素有一定的降解效果。

由于高分子聚合多酚的结构复杂，因此将样品直接注射入HPLC或者ESI-MS很难将其分离检测。在之前的研究中，对红酒多酚进行“分段”处理，在酸性条件下，采用苄硫醇为降解试剂，对酒龄一年的干红葡萄酒中的高分子聚合物多酚进行化学降解，对降解产物进行分析检测，并计算其平均聚合度[6]。并且，聚合程度不同的原花青素，以及花色苷-原花青素缩合产物（直接、间接）也成功的被检测到存在于高分子聚合多酚中[21]。

2013年，Wollmann等[7]采用了HPLC-MS/MS、MALDITOF MS、HPLC-UV/Vis和Ion Chromatography对高分子聚合多酚的结构特征进行分析，结果表明，高分子聚合多酚的结构骨架是由原花青素类的物质构成的，(-)-儿茶素、(+)-表儿茶素、(-)-表儿茶素没食子酸酯被检测到作为终端和延展单元，(-)-表没食子儿茶素仅作为延展单元。花翠素葡萄糖苷、花青素葡萄糖苷、甲花翠素葡萄糖苷、甲基花青素葡萄糖苷、二甲花翠素葡萄糖苷这5种常见的花色苷被检测到作为终端单元存在于高分子聚合多酚中。小分子酚酸、氨基酸也同时被检测到。乙醛作为葡萄酒中酒精发酵的副产物，在其存在的条件下，原花青素类化合物可通过1,1-乙烯桥键互相连接缩合，该反应发生原花青素类化合物的A环上，同时，花色苷和吡喃花色苷也会通过C-C键与原花青素类物质连接缩合。

3 高分子聚合多酚的生物活性研究

近几十年来，针对红酒多酚生物活性研究有大量的研究报道。其主要研究对象为原花青素单倍体[22-23]、二聚体与三聚体[24]、白藜芦醇及其衍生物[25]、黄酮及黄酮醇[26]、酚酸[27]及花色苷类化合物[28-29]。然而，目前国内外关于葡萄酒高分子聚合多酚的研究报道较少，且仅集中在高聚原花青素。

关于红酒多酚的体外活性研究，Sun等采用DPPH法对红酒中多酚类物质（低聚体原花青素、高聚体原花青素、花色苷及其衍生物混合体、聚合色素）以及儿茶素、表儿茶素、槲皮素、二甲花翠素葡萄糖苷这4种酚类化合物标准对照品进行了相关研究。结果表明，这些红酒多酚类物质具有较强的清除自由基的能力，具有体外抗氧化活性，首次为红酒中多聚原花青素的体外抗氧化活性提供了直接证据[30]。

关于聚合多酚体内活性研究报道较少，Déprez等[31]研究表明，高聚原花青素被人结肠微生物群降解成为小分子酚酸，首次证明饮食摄入的聚合多酚类化合物在体内可被降解成小分子化合物，根据代谢产物的类型，直接证明了原花青素具有相应的营养价值。2009年，Kimura等[32]通过对小鼠进行口服脂肪耐量试验，结果表明从日本七叶木中提取得到的高聚原花青素，具有抑制脂肪消化的功能，证明了聚合多酚可以作为营养剂使用，具有潜在的抗肥胖功能。最近，Masumoto等[33]的研究表明，苹果中的聚合多酚会影响肠道微生物菌群的代谢，从而对代谢平衡产生有益的影响。

4 高分子聚合多酚的研究展望

针对目前高分子聚合多酚的研究，还存在着许多的不足之处，笔者认为主要有以下3个方面：首先，研究者们获取得到的葡萄酒中高分子聚合多酚为混合粗提物，其中不仅有高分子聚合多酚存在，单体花色苷及低聚原花青素类物质也存在于其中，从而造成对高分子聚合多酚的分析及活性研究显得并不那么准确。因此，寻找一种有效的方法来获得并大量制备出纯化的高分子聚合多酚组分是必要的。另外，高分子聚合多酚结构复杂，还有大量的结构组成没有被揭示，因此选择合适的降解方法、降解条件及检测方法来分析鉴定降解后的单体碎片，从而继续揭示高分子的结构组成特征是必要的。最后，不同葡萄品种，以及是否经过橡木桶的陈酿对葡萄酒产生重要影响的因素是否会改变高分子聚合多酚的结构组成，也是我们应该关注的焦点。