DNA辅助识别的西马特罗分子印迹传感器

张连明 张东友 曾英 李建平

摘 要 利用DNA改善印迹孔穴对模板分子空间识别性能，建立了高选择性印迹材料的制备新方法，并用于痕量西马特罗的测定。在金电极表面自组装固定双链DNA，待西马特罗与DNA双链进行结合后，以西马特罗-DNA复合物为模板，电聚合制备西马特罗-DNA复合物的分子印迹聚合物膜。去除待测分子西马特罗，得到对西马特罗具有高特异性识别能力的分子印迹传感器。对传感器制备及工作条件进行了优化，利用紫外吸收光谱对西马特罗与DNA的结合方式进行了研究。结果表明，二者之间的相互作用模式为沟槽式结合。印迹膜以乙醇-乙酸（8∶1，V/V）为洗脱剂，洗脱时间为35 min，重吸附时间为45 min。以铁氰化物作为探针，其氧化电流与西马特罗浓度在1.0 × 1013～1.0 × 1010 mol/L范围内呈线性关系，检出限为3.2×1014 mol/L（S/N=3）。将传感器成功应用于猪肉样品中西马特罗的检测，结果良好。

关键词 分子印迹； 西马特罗； 电化学传感器； DNA； 选择性识别

1 引 言

西马特罗（Cimaterol，CIM）是继莱克多巴胺、沙丁胺醇和克伦特罗之后的新型“瘦肉精”[1]。因西马特罗可以减少胴体脂肪含量，促进家畜生长，改变肉质，经常被非法加入到肉畜饲料中[2]。长期大量使用西马特罗会使其在动物组织内积累残留，造成食用者中毒，产生目眩、恶心、呕吐、心率加快等症状，严重者可导致死亡[3]。我国农业部公告第193号文件明确规定西马特罗禁止在畜禽生产中使用[4]。现有的检测动物组织中西马特罗的方法主要有气相色谱-质谱法[5，6]、高效液相色谱法[7，8]、液相色谱-串联质谱法[9，10]、酶免疫分析法[11，12]和毛细管电泳法[13，14]等。但是，这些方法均存在一定的缺陷，如样品前处理繁琐、检测耗时过长、样品中组份对分析干扰较大等[15]。因此，发展操作简便、灵敏度高、选择性好、无需复杂前处理过程的西马特罗残留检测方法具有重要意义。

分子印迹聚合物（MIPs）是一类对目标分子具有专一性识别能力并具有记忆功能的聚合物[16～18]。虽然各种瘦肉精分子印迹聚合物已见报道[15，19]，但是，这些分子印迹聚合物由于印迹孔穴识别单元种类和数量不多， 尚不能对结构相近、官能团相似的瘦肉精分子作有效地分辨[20]。因此，提高印迹聚合物材料的专一性识别能力，发展高特异性西马特罗识别方法很有必要。

DNA由于其特殊链状结构及含有丰富的活性基团已被广泛应用于分子识别领域。Nicholas等[21]利用单链DNA（ssDNA）与蛋白质之间的结合作用，制备了蛋白质分子印迹聚合物。Li等[22]以林可霉素分子为靶物质，在碱基库中筛选出对其具有高亲和性的适配体，以适配体-林可霉素复合物为模板分子电聚合于石墨烯表面，发展了一种适配体-分子印迹传感器制备方法，该方法借助ssDNA的基团增加印迹膜的识别位点可以增强MIPs的识别能力，然而，印迹孔穴内模板分子空间排列的立体选择性并没有得到有效改善。研究表明，不同碱基互补可以形成不同的双链DNA（dsDNA）沟槽结构，生物分子可以嵌入dsDNA的沟槽[23，24]，这种结合方式对生物分子在印迹孔穴中的空间排列可提供构象选择性。

本研究将dsDNA与有机分子沟槽结合产生的构象选择性引入分子印迹聚合物材料的制备，以进一步提高印迹聚合物的专一性识别能力。以西马特罗为目标分子，通过AuS键将dsDNA固定在金电极表面，待 dsDNA与西马特罗分子结合后，以复合物为模板，电聚合形成分子印迹聚合物。去除西马特罗后，得到与西马特罗在作用位点、结构及3D构象相匹配互补的印迹孔穴，据此对西马特罗进行高选择性识别； 采用铁氰化物作为探针，实现西马特罗的定量测定。识别机理如图1所示。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

PGSTAT 128N Autolab电化学工作站（瑞士万通有限公司），采用三电极系统：工作电极为DNA/MIPs修饰金电极（Φ=3 mm），Ag/AgCl（饱和KCl）电极作为参比电极，铂丝电极作为对电极； UV-2400PC紫外-可见分光光度计（日本岛津公司）； S4800场发射扫描电子显微镜（日本日立有限公司）。

西马特罗（CIM）、盐酸克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、班布特罗、马布特罗、西布特罗、溴布特罗标准品（德国Witega Laboratorien公司）； DNA序列（ssDNA序列为：AGAGAG-C6-3′-SH，互补DNA序列为：SH-5′-C6-CTCTCT）由上海生物工程技术服务有限公司合成，使用时用TE缓冲液（10.0 mmol/L Tris-HCl，100.0 mmol/L NaCl，1.0 mmol/L EDTA，pH 8.0）配制和稀释； 0.1 mol/L HCl，乙醇-乙酸混合液（8∶1，V/V）、 乙酸乙酯、 10% Na2CO3溶液、 Tris-HCl缓冲溶液（0.24 mol/L HCl，0.002 mol/L Tris，pH 7.47）、 0.05 mol/L 三（2-甲酰乙基）膦盐酸盐（TCEP）、 邻苯二胺（o-PD，Aladdin公司）。探针分子溶液是含有0.1 mol/L KCl的0.05 mol/L K4[Fe（CN）6]/K3[Fe（CN）6]溶液，若无特殊说明，所用试剂均为分析纯。实验用水均为二次去离子水。

2.2 DNA/MIPs、DNA/nMIPs及常规印迹传感器的制备

将金电极用氧化铝粉在麂皮上打磨至镜面。将ssDNA与其互补链分别取出解冻10 min并离心， 用TE缓冲液溶解，并用TCEP溶液进行活化1 h后得到1.0×105 mol/L ssDNA及互补链（TCEP活化的目的是将巯基修饰的ssDNA之间自然形成的双硫键断开，便于AuS键结合）。将金电极浸入ssDNA溶液2 h，使ssDNA通过AuS键结合于金电极表面，将上述修饰电极浸入互补DNA链溶液2 h， 得到杂交后的dsDNA修饰金电极。将修饰dsDNA的金电极置于4.6×105 mol/L西马特罗溶液中孵育3.5 h， 使西马特罗与dsDNA结合。以1.0×104 mol/L 邻苯二胺为功能单体，电聚合制备得到印迹聚合物膜（循环伏安扫描电位范围：0～0.8 V，扫描速率为0.05 V/s，扫描圈数为25）。以乙醇-乙酸（8∶1， V/V）为洗脱液，将上述修饰电极置于洗脱液中轻微搅拌35 min， 除去西马特罗，得到对西马特罗具有特异性识別能力的DNA/MIPs传感器。利用相同方法制备了非分子印迹修饰电极（DNA/nMIPs传感器，制备过程中不添加西马特罗）及常规分子印迹传感器（MIPs传感器，制备过程中不添加DNA）。

2.3 实验方法

将传感器置于不同浓度的西马特罗溶液中重吸附45 min后检测。在含有0.1 mol/L KCl的0.05 mol/L K4[Fe（CN）6]/K3[Fe（CN）6]的探针溶液中，考察传感器的电化学性能。差分脉冲伏安法（DPV）参数为：初始电位0.2 V，终止电位+0.6 V，振幅0.05 V，扫速50 mV/s。交流阻抗法（EIS）频率范围为100 mHz～100 kHz，振幅为5 mV。

2.4 样品处理

猪肉样品购于本地超市， 按农业部标准方法（NY/T 486-2006）处理[25]。取5 mL乙酸乙酯和0.6 mL 10% Na2CO3加入1.0 g磨碎的样品搅拌均勻，经3500 r/min离心，收集有机层，重复操作并收集提取液，待测。

3 结果与讨论

3.1 自组装时间及杂交时间的选择

考察了ssDNA自组装时间（图2，曲线a）及互补DNA杂交时间（图2，曲线b）对电极电化学响应信号强度的影响。当ssDNA浓度为1.0×105 mol/L时，响应信号随自组装时间延长而明显降低，

当自组装时间超过120 min后，响应信号强度趋于稳定，表明自组装过程达到饱和。将上述修饰电极置于1.0×105 mol/L互补链溶液中进行孵育杂交，随着杂交时间延长，响应信号强度逐渐下降，于120 min后趋于稳定。因此选择自组装时间及杂交时间均为120 min。

3.2 dsDNA与西马特罗相互作用研究

利用紫外-可见吸收光谱法研究了西马特罗与dsDNA之间的相互作用。作用时间对CIM-dsDNA复合物形成的影响如图3A所示，修饰电极响应信号强度随着孵育时间的延长而显著降低，表明随着孵育时间延长，越来越多的西马特罗与dsDNA结合，当孵育时间达到210 min后， 西马特罗的结合量达到饱和，响应信号强度趋于稳定。因此，后续实验选择西马特罗与dsDNA的作用时间为210 min。 以Tris-HCl为缓冲液，分别研究了1.2 × 107mol/L西马特罗溶液、1.2 × 107 mol/L dsDNA溶液及1.2 × 107 mol/L 西马特罗-dsDNA复合物溶液的吸收光谱（图3B）。结果表明，西马特罗在320 nm处有明显的紫外吸收，而dsDNA在290 nm处有最大吸收，西马特罗与dsDNA相互结合后，西马特罗-dsDNA （CIM-dsDNA） 复合物最大吸收波长位于320 nm，同时其最大吸收峰强度明显增强，表明dsDNA与西马特罗通过弱作用力相互结合，无新官能团产生。上述结论与文献[26]相同。

3.3 聚合条件的选择

以洗脱效果、印迹膜稳定性及识别效果为考察标准，利用DPV研究了聚合物底液中模板分子西马特罗与功能单体（邻苯二胺）的配比、扫描速率和电聚合扫描圈数的影响。扫速及扫描圈数直接影响印迹膜的厚度及致密度，进而影响洗脱效果及识别效果。实验结果表明，在1.0 × 105 mol/L ssDNA、1.0 × 105 mol/L互补链及4.6 × 105mol/L西马特罗条件下，使用1.0 × 104 mol/L o-PD作为功能单体、扫描速率为0.05 mV/s、电聚合扫描圈数为25圈时，传感器对目标分子响应效果最佳。

3.4 DNA/MIPs及DNA/nMIPs传感器对西马特罗的响应

为验证DNA/MIPs传感器对西马特罗的识别响应，对传感器制备过程中的电化学性能进行了研究。如图4A所示，裸金电极（曲线a）具有良好的导电性，而dsDNA（曲线b）及西马特罗-dsDNA复合物（曲线c）在电极表面组装后，修饰电极响应信号强度随修饰物的增加而减弱。继续聚合一层致密的聚o-PD层后，由于聚合物层的存在， 严重阻碍了电子的传递，响应信号强度急剧下降（曲线d）。洗脱西马特罗后，印迹孔穴可以作为电子传递的通道，响应信号增强（曲线e）； 当重吸附不同浓度西马特罗后，西马特罗重新占据印迹孔穴通道而阻碍电子传递，响应信号强度随西马特罗浓度增加而降低（曲线f和曲线g）。上述结果表明，本方法制备的印迹材料能够识别西马特罗。

为了进一步证明上述结论，利用交流阻抗法对上述过程进行了研究（图4B），当dsDNA-西马特罗复合物修饰在裸金电极表面后（曲线b），其阻抗值较裸电极（曲线a）明显增加，聚合后，由于存在致密的、导电性差的聚合物膜，阻碍了电子的传递过程， 因此敏感膜阻抗值较CIM-dsDNA修饰电极明显增大（曲线c）； 洗脱目标分子后，由于印迹孔穴可以作为电子传递的通道，因此阻抗值降低（曲线d），而重吸附西马特罗后，印迹孔穴通道被堵塞，敏感膜阻抗值增加（曲线e）。综上，本方法制备得到的印迹聚合物材料对西马特罗有识别能力，所得结论与DPV响应结论一致。

为了排除物理吸附的干扰，研究了非分子印迹膜DNA/nMIPs传感器对目标分子西马特罗的识别能力。如图4C所示，将dsDNA修饰在电极表面后，探针分子响应明显（曲线a）。电聚合后，由于致密的聚合物膜存在，修饰电极响应信号强度急剧降低（曲线b），而洗脱后，修饰电极响应信号强度无较大变化（曲线c），重吸附西马特罗后，修饰电极响应信号强度仍无明显变化（曲线d），这是因为聚合过程中未加入西马特罗，因此洗脱后无任何印迹孔穴产生，即不会产生探针分子到达电极表面的通道，因而响应信号基本无变化。重吸附后，西马特罗不能稳定存在于敏感膜表面，因此响应信号无明显变化。上述研究表明DNA/nMIPs修饰电极对西马特罗无任何响应。

3.5 分子印迹聚合物膜形貌表征

利用扫描电镜（SEM）对金电极表面电聚合制备的dsDNA/MIPs敏感膜进行了形貌分析，如图5所示，电极表面的分子印迹膜覆盖较为完整，分布较为致密。

3.6 实验条件优化

综合考虑洗脱效果、印迹材料稳定性、 DNA双链结构的影响等因素，分别以乙醇、甲醇、二甲亚砜、乙酸、HNO3-H2O混合液（1∶1，V/V）、乙醇-乙酸混合液（8∶1，V/V）、甲醇-乙酸混合液（8∶1，V/V）作为洗脱剂， 考察洗脱效果。实验结果表明，以乙醇-乙酸混合液（8∶1，V/V）作为洗脱液，洗脱时间较短，对印迹膜的稳定性影响最小。同时，随着洗脱时间延长，传感器响应信号强度逐渐增大，表明越来越多的目标分子被洗脱，当洗脱时间超过35 min后，传感器响应信号强度不再变化，并趋于稳定，因此选择最佳洗脱时间为35 min。

传感器对西马特罗的识别过程中，不仅要满足dsDNA对其的构象识别，同时也要满足印迹孔穴对其结构、大小及作用位点的互补识别。考察了重吸附时间对识别4.6× 1010 mol/L西马特罗的影响，结果表明，随着重吸附时间延长，传感器响应信号强度逐渐降低，并于45 min后趋于稳定，表明西马特罗与dsDNA的结合及印迹孔穴的结合达到饱和。因此选择重吸附饱和时间为45 min。

3.7 传感器对西马特罗的分析性能

在最佳实验条件下，考察了传感器对不同浓度的西马特罗溶液响应情况（图6）。西马特罗的浓度在1.0×1013～1.0×1010 mol/L范围内，随着浓度增大，传感器响应信号强度逐渐降低，且传感器响应信号强度与西马特罗浓度呈线性关系，线性方程为Δi（μA）=9.255lgC-87.47，相关系数r=0.9960， 检出限（3S/K）为3.2×1014 mol/L （0.007 ng/L）。与已报道方法相比，本方法具有较高的灵敏度（表1）。

3.10 实际样品分析

按照2.4节的方法对猪肉样品进行处理，将DNA/MIPs传感器与样品待测液孵育45 min，记录电化学响应信号值。同时，进行加标回收实验（样品2加标后超出检测范围，经稀释后检测）。结果如表2所示，DNA/MIPs传感器对西马特罗测定结果的回收率为94.0%～105.5%，与HPLC法所得结果一致[31]，表明此传感器可应用于猪肉样品中西马特罗检测。

4 结 论

将dsDNA-有机分子的嵌合作用与分子印迹技术相结合，以固化分子印迹孔穴内模板分子的空间排列，有效提高了分子印迹膜的识别能力。本传感器构建策略适用于可与DNA进行沟槽式结合的有机分子的分离测定，为食品等复杂样品分析检测提供了一种新方法。

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