高分子刷/银纳米粒子复合表面增强拉曼散射基底检测群体感应信号分子

王向东 张倩 褚立强

摘 要 利用原子转移自由基聚合技术（ATRP）在硅片上合成聚甲基丙烯酸寡聚乙二醇酯（POEGMA）高分子刷，采用多次浸泡法在高分子刷中固定多层银纳米粒子（AgNP），形成POEGMA/AgNP复合SERS基底。扫描电镜和紫外-可见吸收光谱分析表明，纳米粒子成功固定到POEGMA高分子刷中并具有一定的三维排列。利用此SERS基底检测了绿脓杆菌以及两种代表性的QSSM分子（即绿脓素（PCN）和N-十二酰基高丝氨酸内酯（C12-HSL））。实验结果表明，此SERS基底对PCN的检出限为1010 mol/L，C12-HSL的检出限为108 mol/L，绿脓杆菌的检出限为10 CFU/mL。拉曼测试结果表明，POEGMA/AgNP纳米复合SERS基底可以对绿脓杆菌和绿脓素进行同时检测和区分。结合SERS技术的免标记、高灵敏性以及受水干扰小等优势， POEGMA/AgNP纳米复合SERS基底有望用于群体感应现象的研究。

关键词 表面增强拉曼散射； 群体感应； 绿脓杆菌； 绿脓素； 高分子刷； 银纳米粒子

1 引 言

诊断并抑制细菌感染对于医疗卫生、环境保护、国土安全、食品加工和存储等领域都至关重要。绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa， PAE）是一种常见的机会性致病菌，在伤口部位或人体免疫系统功能受损时，可引起急性和慢性感染，具有较高的致死率[1～3]。造成绿脓杆菌耐药性强和难治愈的主要原因是绿脓杆菌极易形成生物膜，而生物膜的特殊结构使其免受人体免疫系统和抗生素的攻击[4～6]。研究表明，绿脓杆菌主要是通过群体感应（Quorum sensing， QS）机制来调控生物膜的形成[7～9]。

群体感应是指细菌之间通过分泌和感知特定的信号分子来进行相互交流并调节自身生理行为的一种调控机制，可以使细菌群体更好地适应复杂的环境变化[10～13]。简言之，细菌会分泌一种或多种低分子量的群体感应信号分子（QSSM，又被称为自诱导剂），当菌体密度升高或QSSM浓度达到一定阈值后，细菌自身会启动相应的一系列基因的表达，以调节细菌群体的行为。自从1994年群体感应概念被提出以来，人们发现细菌的许多生理过程都由这种机制来调节，包括细菌分化、菌体发光现象、生物膜的形成和毒素分子的产生等[14～16]。

在绿脓杆菌的群体感应机制研究过程中，研究者发现有多种信号分子可以调控细菌行为，最常见的一类信号分子是酰基高丝氨酸内酯化合物（Acyl-homoserine lactone， AHL），对于绿脓杆菌的毒性调控十分重要[17，18]。绿脓素（Pyocyanin ， PCN）也是绿脓杆菌产生的一种非常重要的群体感应信号分子和毒素分子[19，20]， 可以抑制细胞呼吸功能和表皮细胞生长，引起环前列腺素释放并破坏钙稳态[21，22]。迄今为止，已有多种分析技术被用于检测QSSM，包括气相色谱-质谱法[23]、薄层色谱法[24]、高效液相色谱法[25， 26]、液相色谱质谱联用法[27～29]、生物化验[30]、二维关联能谱法等[31]。这些检测技术通常成本较高，并且周期长。因此，开发一种不需要基因操作或标记的方法用于QSSM的原位检测十分必要。

表面增强拉曼散射光谱（SERS）作为一种超灵敏、免标记、非侵入性的光学检测技术，可以通过独特的指纹图谱同时检测多种不同分子，为生物分析和原位检测提供了新的策略，近年来众多研究者开始利用SERS技术检测QSSM和各种细菌[32～37]。本研究以聚甲基丙烯酸寡聚乙二醇酯（POEGMA）高分子刷为基质，利用多次浸泡法固定多层银纳米粒子（AgNP），制备了POEGMA/AgNP纳米复合SERS基底。利用此基底检测了绿脓杆菌以及两种代表性的QSSM分子： 绿脓素和N-十二酰基高丝氨酸内酯（C12-HSL）。实验结果表明，POEGMA/AgNP复合SERS基底可以高灵敏地同时检测绿脓杆菌和绿脓素。

2 实验部分

2.1 仪器与試剂

显微拉曼光谱仪为实验室自主搭建，采用热电冷却 CCD 探测器（BTC 162E2-532H， 上海必达泰克光电科技有限公司）和532 nm固体激光器（MSL-FN-532， 功率为4 mW，长春新光电产业）； SU8000型扫描电子显微镜（日本日立公司）； Cary100型紫外-可见分光光度计（美国安捷伦科技有限公司）； MJ-54A高压蒸汽灭菌锅（施都凯仪器设备上海有限公司）。

甲基丙烯酸寡聚乙二醇酯（OEGMA， Mn= ～360 g/mol）、三乙胺（99%）、2-溴代异丁酰溴（BIBB， 98%）柠檬酸钠（99%）、KCl（99.8%）、Na2HPO4·12H2O（99%）、KH2PO4（99%）、绿脓素（优级纯）、N-十二酰基高丝氨酸内酯（C12-HSL， 分析纯，Sigma-Aldrich公司）； 蛋白胨和酵母粉提取物（分析纯， OXOID公司）； AgNO3（99%，天津德兰精细化工有限公司）； 三氨丙基三乙氧基硅烷（APTES，99%，西亚试剂有限公司）； CuBr（98%，北京百灵威科技有限公司）； 2，2′-联吡啶（99%，梯希爱（上海）化成工业发展有限公司）； PAK型绿脓杆菌（天津科技大学工业发酵微生物重点实验室）。实验用水为超纯水。

绿脓素溶液的配制：将绿脓素溶于乙醇-超纯水（1∶1， V/V）中，配制成5×104 mol/L，密封好置于冰箱中避光保存，后期使用时用超纯水通过10倍稀释法稀释。N-十二酰基高丝氨酸内酯溶液的配制：将C12-HSL溶于色谱级甲醇溶液中，配制成浓度为1×103 mol/L的溶液，使用时用超纯水通过10倍稀释法稀释。图1为绿脓素和N-十二酰基高丝氨酸内酯的化学结构式。

2.2 高分子刷/银纳米粒子复合SERS基底的制备

本研究中所用SERS基底参照文献[38]方法制备，其过程如图2所示。首先在1 cm×1 cm单晶硅片上利用原子转移自由基聚合法制备POEGMA高分子刷，其干膜厚度约为48.6 nm。利用种子生长法制备直径为25.8 nm的银纳米粒子。然后将POEGMA高分子刷浸泡在银纳米粒子溶液中，浸泡20 min后取出，用大量超纯水冲洗基底，N2吹干。之后再将基底浸泡到银纳米粒子溶液中，如此重复18次，获得具有多层银纳米粒子的复合SERS基底。

2.3 绿脓杆菌样品的制备

Luria-Bertani（LB）培养基的配制： 用超纯水配制1%（w/w）蛋白胨、1%（w/w）NaCl、0.5%（w/w）酵母提取物的混合溶液，用0.5 mol/L NaOH溶液调节至pH 7.3。磷酸盐缓冲液（PBS）的配制： 分别称取Na2HPO4·12H2O（3.628 g）、 KH2PO4（0.24 g）、 NaCl（8 g）和KCl（0.2 g），溶于800 mL水中，调节至pH 7.4， 超纯水定容至1000 mL。将上述配制好的LB培养基、PBS缓冲液及容器等全部于121℃高压灭菌20 min。

接种细菌：在200 mL LB培养基中加入10 μL菌种，于恒温摇床中37℃培养20 h（180 r/min）。菌种为PAK型的绿脓杆菌，储存在甘油管中置于冰箱冷冻。PBS稀释菌液：用紫外-可见分光光度仪定波长扫描（波长为600 nm）检测菌液的OD值，确定菌液的初始的OD值，4000 r/min离心5 min ，弃上清液，用PBS缓冲液将离心后的细菌稀释至OD=0.5，此时细菌浓度约为4×108 CFU/mL[39，40]，然后采用10倍稀释法用PBS稀释菌液，使菌液达到相应浓度。

2.4 拉曼光谱检测

室温下，将100 μL QSSM溶液（即PCN或C12-HSL）滴在SERS基底表面，待溶液蒸发干后采集SERS光谱。绿脓杆菌SERS光谱的采集：将SERS基底放置于菌液中，在摇床上摇动2 h（80 r/min），然后取出进行拉曼检测。SERS光谱采集参数如下：拉曼位移范围200～3500 cm1，积分时间50 s。每个样品选不同位置，重复测量5次。

3 结果与讨论

3.1 高分子刷/银纳米粒子复合SERS基底的表征

图3A是经过18次浸泡后获得的复合SERS基底的SEM图，可以看出银纳米粒子分布均匀。图3A中有一些比较暗的纳米粒子，显示银纳米粒子具有一定的三维分布，此结果说明多次浸泡的方法可以促进银纳米粒子在POEGMA高分子刷中的固定。利用ImageJ软件对图3A中纳米粒子的粒径进行统计，其粒径分布图如图3B所示，银纳米粒子的粒径为（30.3±7.2） nm。图3C为制备好SERS基底的UV-Vis吸收光谱图，此实验过程中将硅片换成了石英玻璃片。如图3C所示，单纯POEGMA高分子刷基底没有出现任何吸收峰，而当浸泡18次后，复合SERS基底在425 nm处出现了明显的吸收峰，表明经过18次重复浸泡后，基底上已经固定大量的银纳米粒子。此结果与本研究组之前的研究结果基本一致[38]，说明采用多次浸泡法可以方便地制备含有多层银纳米粒子的复合SERS基底。当银纳米粒子分布均匀且相距较近时，银纳米粒子之间可发生电感耦合产生电磁场增强，形成SERS“热点”[41]。

3.2 绿脓素和N-十二酰基高丝氨酸内酯的SERS检测

根据文献[42～44]，对于群体感应信号分子PCN和C12-HSL，以及绿脓杆菌的拉曼光谱峰的归属见表1。 不同浓度的PCN和C12-HSL溶液的SERS光谱图见图4A和4C。图4A中， 427、550、617、1352和1560 cm1处拉曼峰为PCN的特征峰，并且峰强度随浓度增大而增强，这与文献[36，43，44]相符。对1352 cm1处的拉曼峰进行积分， 表示PCN检测强度（图4B）。综合图4A和4B可知，SERS基底对PCN的检测极限为1010 mol/L，并且可实现对PCN的半定量分析。在图4C中，606、1364和1646 cm1处拉曼峰为C12-HSL的特征峰，其强度随浓度增大而增强。对1646 cm1处的拉曼峰积分用于表示C12-HSL检测强度，如图4D所示。综合图4C和4D可知，SERS基底对C12-HSL的检出限为108 mol/L，但检测信号误差较大。C12-HSL的检出极限比PCN的差，这是因为带有共轭结构的PCN分子的SERS效应更强[45]。 生物体系中QSSM分子的相关浓度范围是106～109 mol/L[36，46]，本研究制备的SERS基底检测的PCN和C12-HSL的浓度范围符合生物学检测要求。因此，有望利用SERS基底在细菌生成生物膜之前检测QSSM分子，實现对细菌生物信号分子的干预并抑制生物膜的形成。

3.3 绿脓杆菌的SERS检测

图5A是不同浓度绿脓杆菌的SERS光谱图。664、720和1493 cm1等吸收峰为绿脓杆菌的拉曼特征峰，峰的强度随细菌浓度增大而增强。在绿脓杆菌的SERS光谱中，在412、604、1352 cm1处也出现了峰，均为PCN的特征峰， 这是因为在绿脓杆菌生长过程中会分泌PCN。选用 1493 cm1处的拉曼峰积分用来表示绿脓杆菌检测强度，结果如图5B所示，SESR基底可以检测绿脓杆菌的浓度范围为10～104 CFU/mL， 检出限为10 CFU/mL，因此可对绿脓杆菌进行半定量分析。

3.4 绿脓杆菌和绿脓素SERS谱图对比分析

将POEGMA/AgNP复合基底用于绿脓杆菌和绿脓素混合样品的检测。

图6b和6c是单独测量绿脓素和绿脓杆菌时获得的SERS谱图，其中绿脓素和绿脓杆菌的样品处理和测试过程保持一致。对比图6b和6c可知，绿脓杆菌和绿脓素虽然存在一些重合的峰，但是由于绿脓杆菌会出现不同的特征峰，因此本研究中制备的复合SERS基底可以区分绿脓素与绿脓杆菌。图6d是将1×105 mol/L绿脓素和4×104 CFU/mL绿脓杆菌混合后测量的拉曼谱图。可见混合样品部分拉曼峰的位置会发生改变，如1493 cm1处的峰会移至1523 cm1，664 cm1处的峰会被遮挡，但是仍可以观察到绿脓杆菌和绿脓素各自的特征峰。该结果表明，用SERS基底区分混合液中的绿脓杆菌和绿脓素是可行的。这为在绿脓杆菌溶液中原位检测绿脓素，并进一步研究群体感应机制奠定了基础。

4 結 论

利用POEGMA聚合物刷与银纳米粒子构建的SERS基底可以检测并区分两种生物信号分子：绿脓素和N-十二酰基高丝氨酸内酯，检出限分别为1010 mol/L和108 mol/L，在生物学QSSM的相关浓度范围内， 基底对绿脓杆菌的检出限为10 CFU/mL，并且可以实现对绿脓杆菌和绿脓素的区分和鉴别。SERS基底的高灵敏性和指纹识别能力，为群体感应信号分子在生物体系中的原位检测提供了新思路，为群体感应体系的研究提供了新方法。

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