甜樱桃病毒病及苗木脱毒技术研究进展

付全娟，魏国芹，侯森，杨兴华，孙玉刚

(山东省果树研究所，山东泰安 271000)

甜樱桃(PrunusaviumL．)为蔷薇科李属樱亚属植物，原产于欧洲，引入中国栽培已有一百多年，是目前栽培效益最高的果树之一。甜樱桃果实外观鲜艳、风味独特、营养丰富，素有“春果第一枝”的美誉。中国自19世纪70年代开始引种栽培甜樱桃，目前栽培面积达到14万hm2，产量约50万t[1]。但是，随着樱桃产业的发展，病毒病逐渐成为影响甜樱桃产量和质量的重要因素[2,3]。

Nemeth(1986)认为樱属病毒主要有 68 种，其中可以侵染甜樱桃的病毒约有 34 种，常见的主要有20种[4]，其中11种已在中国相继发现并报道[5]。Pallas(2012)研究表明，甜樱桃病毒病发生率为45.6%，其中76.4%为多种病毒混合侵染导致[6]。甜樱桃病毒病主要引起树体衰弱、叶片卷曲、花叶或环斑、果实畸形或小果或病害如流胶、根癌病易发生，甚至树体死亡。当今世界各主产国对甜樱桃病毒病主要通过培育脱毒苗进行防治，因此苗木的病毒脱除技术是脱毒苗培育的关键。目前苗木的脱毒技术可分为热处理法、微茎尖法、化学药剂法和基因工程技术4大类[7]。笔者对国内常见的几种病毒病和常用脱毒技

术进行综述，为甜樱桃无毒栽培及无病毒苗木的培育提供理论和技术支持。

1 甜樱桃常见病毒病

1.1 李属坏死环斑病毒(PNRSV)

PNRSV是雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)家族中的一种球形植物病原病毒，也是分布最广、危害最严重的李属病毒。Pimentel(2007)认为甜樱桃树感染该病毒后，容易并发樱桃卷叶病毒(CLRV)，导致产量快速下降[8]。感染该病毒易引起樱桃坏死环斑病和皱缩花叶病，症状有坏死环斑、线纹、带状叶、粗花叶，有时还会产生耳突，病叶呈破碎状，出现坏死斑、穿孔、脱落，严重的甚至全株枯死。该病毒主要通过机械、种子、花粉、线虫等多种途径传播，也可以通过受侵染的植物繁殖材料的调运进行远距离传播。因此各国对PNRSV的检疫十分重视，1992年中国将其列为入境检疫危险性有害生物[9]。

1.2 李矮缩病毒(PDV)

PDV是雀麦花叶病毒科等轴不稳环斑病毒属成员之一，病毒粒子呈球形，可引起樱桃黄化花叶病、樱

桃褪绿环斑病，与PNRSV侵染植物的症状相似，造成树体发育不良、叶片畸形、褪绿环斑、坏死斑和黄化花叶等症状。PDV与PNRSV两种病毒常伴随侵染。单独性或和其他病毒复合性的侵染会影响果实的产量和树木的生长。主要通过嫁接、种子、花粉传播。PDV在全世界普遍发生，为中国入境检疫危险性有害生物[11]。

1.3 樱桃绿环斑驳病毒(CGRMV)

CGRMV属于乙型线性病毒科(Betaflexiviridae)，病毒粒子呈弯曲的线条形，长 1000～2000nm。其寄主范围广，可侵染甜樱桃、酸樱桃、观赏樱桃、桃、杏等多种李属植物，广泛分布于非洲、亚洲(主要是中国和日本)、南美洲、新西兰等地。CGRMV感染甜樱桃后无明显症状，是一种典型的潜隐性病毒，感染酸樱桃后，叶片出现黄色或绿色斑驳，果实畸形，味苦，经济效益低[4]。

1.4 樱桃小果病毒(LChV)

引起樱桃小果病的几个分离物LChV-1、LChV-2、LChV-3均为长线形病毒科(Clostero -viridae)葡萄病毒属(Ampelovirus)。通过汁液、嫁接和昆虫介体传播，1986年在加拿大发现新的传播介体为苹果粉蚧(Phenacoccusaceris)，侵染樱桃后传播迅速。LChV引起樱桃小果病，其症状多样。叶片边缘有轻微卷曲，带有红黄色的碎边；果实症状通常发生在果实生长初期，收获时感病果实只有正常果实的1/3～1/2大小，果实呈暗红色，畸形，味淡，即使没有出现上述症状，果实也会成熟过晚[7]。

1.5 樱桃病毒A(CVA)

CVA 属于乙型线性病毒科(Betaflexiviridae)毛状病毒属(Capillovirus)，可侵染桃、李、杏和樱桃等李属植物，通过嫁接传播。单独感染后寄主无明显症状，是一种典型的潜隐性病毒，一旦与其他病毒复合侵染，会引起严重病害，该病毒可能是病毒病发生的增效剂，加速病害发生[12]。

1.6 樱桃卷叶病毒(CLRV)

CLRV为豇豆花叶病毒科(Comoviridae)线虫多面体病毒属(Nepovirus)C亚组成员。可以通过剑线虫、种子、花粉、嫁接传播，也可以通过机械摩擦传播。CLRV引起樱桃卷叶病，植株表现为叶芽伸长和开花延迟且生长脆弱，叶边向上卷起，类似枯萎，部分叶片在生长时期会变成紫红色或产生浅绿色的环斑。在同 PNRSV或PDV造成的复合侵染时，能够引起樱桃树势的迅速下降，叶变小，出现脉明、流胶现象，被侵染的树会在5年内死亡[13]。

2 常用脱毒技术

目前甜樱桃常用苗木脱毒技术可分为热处理法、微茎尖法、化学药剂法和基因工程技术4大类。

2.1 热处理法

热处理法的原理是根据感染病毒和寄主植物对高温忍耐程度的差异，在一定的温度下(37～40℃)，病毒被钝化，失去增殖和再感染能力，从而使寄主细胞的生长速度超过病毒扩散速度，即在生长点附近得到小部分不含有病毒的分生组织，切下这部分进行人工培养或嫁接到无病毒砧木上得到无病毒的苗木[7]。热处理的效果与病毒的致死温度没有相关性，但与病毒颗粒的形状有关，线状和球状病毒在一定高温下易被钝化，而对杆状病毒效果较差[4]。选择适当的温度和处理时间是脱毒成功的关键。近年来研究表明，用热处理结合茎尖培养的方法培育无病毒母本苗效果较好，特别是对于一些用单纯的茎尖培养或热处理难以脱除的病毒，采用热处理结合茎尖培养方法可明显提高脱毒效率[14]。

2.2 微茎尖法

病毒在植物体内的不同组织和部位分布不均匀，病毒粒子随着植物组织成熟而增加，旺盛生长的茎尖和根尖一般无病毒或很少，不含有病毒的部分不超过 0.1～0.5mm[15]。

2.2.1 茎尖组织培养 切取樱桃0.1～0.3mm 分生组织培养，能有效消除ACLSV、PDV、CGRMV、LChV、线虫传多角体病毒组病毒(Nepoviruses)、欧洲锈斑驳病毒等多种病毒，并且可以发育出完整的植株[16]。茎尖培养的最大缺点是不易培养，生根和移栽成活率低。另外，茎尖分化率与茎尖大小成正比，脱毒率与茎尖大小成反比，因此脱病毒时要兼顾脱毒率和成活率两个方面。一般切取长度为 0.2～0.5mm带有1～2 个叶原基的茎尖，既可保证一定的成活率，又能使一定数量的茎尖苗不带病毒[4]。伍克俊等[17]在甜樱桃脱毒时，利用热处理结合小茎尖分生组织培养比单独使用小茎尖培养脱毒率高，脱毒率达80%。

热处理结合茎尖培养脱毒法可以达到同时脱除几种病毒的目的，且经热处理长出绿枝可切取较大的茎尖接种培养，既操作方便，易于分化出苗，又降低了变异率，故生产中应用的较多。

2.2.2 微茎尖嫁接法 微茎尖嫁接是Marashige等提出，将组织培养与嫁接方法相结合，用以获得无病毒苗木的一种新技术。一般认为大多数植物的种子是不带毒的，采集砧木种子，表面消毒后播于事先准备好的培养基中培养成苗。2周后，在无菌条件下切下顶部，留下长1～1.5cm的上胚轴部分，取优良品种茎尖1mm，倒丁字水平嫁接在砧木上培养即可。这种技术首先成功应用于柑桔脱病毒，以后逐渐应用到其它多种果树病毒的脱除。Degratias等[18]利用微体嫁接技术脱除了樱桃和桃的褪绿叶斑病毒；马凤桐等[19]用微体嫁接技术得到了柑桔属脱毒苗。微体嫁接除了可培育无病毒植株外，还可解决生根难的问题。目前，微体嫁接成功地获得脱毒苗木的植物有杏、酿酒葡萄、桉树、山茶、桃、李、樱桃、苹果和柑桔等[20]。

2.3 化学药剂脱毒法

某些核酸代谢的拮抗物和抗生素类物质能抑制核苷酸或核酸的生物合成，因此被用来抑制植物病毒。目前国际上常用化学药剂是病毒唑(Ribavirin)和 DHT。病毒唑的三磷酸具有活性，可抑制病毒RNA形成帽子结构，而DHT(2，4-二氧六氢-1，3，5-三嗪)既可破坏RNA聚合酶的合成，又可破坏病毒外壳蛋白的合成，从而抑制病毒的繁殖。

化学药剂脱毒法常与组织培养结合进行，Deogruties等[21]在培养基中添加病毒唑，成功脱除甜樱桃ACLSV、PNRSV、PDV等病毒。Cieslinska[22]采用热处理结合病毒唑方法对感染PDV病毒的甜樱桃进行脱毒处理，脱毒率达到93%。此脱毒法可获得较大的茎尖用于组织培养，但病毒抑制剂易导致后代变异。化学药剂脱毒法的应用效果，因病毒种类而不同，不能脱除所有病毒，但方便快捷，操作简单，故对抗病毒药品的研究和开发具有广阔的前景。

2.4 基因工程技术

利用基因工程技术培育抗病毒的品种是目前防治病毒病的最有效和最根本的办法。研究显示，有效的抗病毒基因主要来源于病毒本身，如外壳蛋白基因、RNA干扰、运动蛋白基因、卫星 RNA、复制酶基因等。

2.4.1 外壳蛋白基因 Bachy首次将烟草花叶病毒(TMV)外壳蛋白基因成功地导入烟草，培育出了能稳定遗传的抗病毒烟草植株；刘辉[23]将苹果茎沟病毒的外壳基因成功导入烟草。研究表明，外壳蛋白基因介导的抗性是由于外壳蛋白的积累干扰了病毒的脱壳，同时抑制了病毒在体内的转运和复制。这是抗病毒植物基因工程上采用最普遍的一种，目前已有30多种植物病毒获得成功。

2.4.2 RNA干扰技术 Orbegozo等[24]将马铃薯卷叶病毒(PLRV)的部分基因片段，构建RNAi载体，获得马铃薯抗性转基因株系。Liu等[25]利用RNAi技术获得核果类病毒PPV、PDV、PNRSV、ToRSV、APLPV、PMV的抗性烟草植株。Song等[26]发现樱桃砧木Gisela 6和Gisela 7转化PNRSV基因干扰载体后可抗PNRSV和PDV的复合侵染。

2.4.3 运动蛋白基因 运动蛋白基因介入是阻断病毒产物表达，限制病毒在植物细胞间的转运，从而达到抗病毒的目的。Martinelli[27]等成功将葡萄病毒 A和B的运动蛋白基因转移到烟草中，获得具有不同程度的抗病毒转基因烟草植株。随后，又将这2种病毒的运动蛋白基因介入葡萄植株，获得具有抗性的再生植株。

为进一步提高工程植株的抗病性，目前人们多采用复合基因策略，即转多种抗性基因控制一种病毒，可以提高转基因植物的抗性强度和抗病的持久性和广谱性，这是转基因抗病毒育种产业化发展的趋势。

3 存在的问题与展望

目前，国际上已有34种樱桃病毒病被相继报道，中国有报道的侵染甜樱桃的病毒有11种，中国对甜樱桃病毒病病原的研究还不全面。有必要结合现代分子生物学技术，如基因杂交、RNA电泳、酶联免疫法、免疫捕捉PCR技术、实时荧光PCR技术等，建立快速有效的检测方法，加强病毒检疫检验。

国内外对于甜樱桃病毒病尚无有效的治疗措施，主要通过培育脱毒苗进行防治。但是脱毒效果受多种因素的影响，如材料的基因型、生长状态、病毒种类、处理条件、操作技术等，所以在选择脱毒方法时，可以用单一的脱毒方法，也可以将几种方法结合使用。另外，抗病毒转基因技术是从作物自身出发，通过基因工程手段转入外源抗病毒基因，并在作物体内表达达到直接抗病毒的目的，将是今后果树无病毒技术研究的热点。