大力加强结核感染与发病机理及其实验室诊断技术的研究

贺文从 赵雁林

近年，随着耐药结核分枝杆菌的产生、MTB与HIV双重感染的增加以及流动人口的增多，全球结核病疫情呈现明显的上升趋势[1]。2016年，我国结核病的患者发病例数居全球当年总发病例数的第三位，仅次于印度和印度尼西亚，占全球总患者例数的10%[2]，防治形势依旧严峻。而深入了解结核感染发生的条件及其演变规律对结核的有效防控至关重要。基于此，笔者从宏观和微观角度分别阐述了结核病的发病历程和发病机理，以期揭示结核感染的发生、发展、传播、转归，及其演变过程，为相关政策的制定和研究的开展提供依据。

着力加强结核感染与发病研究

结核病是由MTB引起的慢性呼吸道传染病，可累及全身多个器官，以肺部受累形成肺结核最为常见。人主要通过吸入带菌的飞沫核而引起感染，其他感染途径如消化道、皮肤、泌尿生殖系统等均较少见[3]。易感者吸入带菌的飞沫核后，一般宿主会通过细胞介导的免疫反应来限制MTB的增殖和扩散。少量、毒力弱的MTB多能被人体免疫防御机制所杀灭而清除，仅当受大量毒力强的MTB侵袭而机体免疫力不足时，感染后才会发病，即为原发性肺结核[4]。原发性肺结核多见于儿童，成人少见，包括原发综合征和胸内淋巴结结核。原发综合征的肺部原发灶好发于上叶下部和下叶上部。初次感染MTB时，由于早期特异性免疫力尚未形成，MTB沿引流淋巴管侵入肺门淋巴结，甚至有早期菌血症，形成播散病灶在其他脏器潜伏下来，成为日后肺外结核病的来源[5]。大多数肺部原发病灶、淋巴管炎和淋巴结炎症状较轻并可自愈，少数由于机体免疫力明显低下或MTB毒力强、数量大及机体剧烈变态反应，发展为原发性肺结核。临床表现为发热、盗汗、咳嗽、食欲不振、体质量减轻等慢性消耗性疾病特征[5]。

结核病的许多症状是宿主的免疫反应导致的，而非MTB的直接毒性作用。从临床症状可以得到如下结论，MTB成功感染需要3个阶段[6]：(1)在巨噬细胞中成功繁殖；(2)MTB能够修饰宿主的免疫反应，使宿主能够控制但不能根除细菌；(3)能够在宿主中相对不活跃的持续存在而保留被激活的潜力。过去研究普遍认为，MTB一旦进入下呼吸道被肺泡巨噬细胞吞噬后，就会不可避免地形成“一旦感染，终生携带”的慢性感染结局[7]。而Ewer等[8]研究表明，在早期感染阶段，少部分人群可清除MTB，只有不到10%的感染者在初次感染后会出现明显的临床症状，而大多数人都可以通过细胞介导的免疫反应形成肉芽肿将感染局限化。MTB侵入人体后 4～8 周，身体组织对MTB及其代谢产物发生迟发型变态反应，局部出现炎性渗出，甚至干酪样坏死，常伴有发热、乏力及食欲减退等全身症状，此时结核菌素皮肤试验(TST)可呈阳性反应[6]。在该生理状态下残留的少量MTB就形成了潜伏结核感染(latent tuberculosis infection, LTBI)状态。潜伏感染者无明显结核病的临床症状体征，亦不会引起结核病的传播流行，但流行病学研究表明，潜伏感染者是活动性结核病发生的主要来源[9]。其高危人群主要包括HIV感染者、接受免疫抑制治疗的患者以及患有慢性系统性疾病患者，包括终末期肾病、风湿性疾病、糖尿病等[10]。

目前研究表明结核病的发生可大致分为两个阶段[10]，第一阶段是LTBI，即MTB感染人体，不产生临床症状和体征，一般通过TST和(或)γ-干扰素释放试验(IGRA)进行诊断；第二阶段是大约 10% 的LTBI患者会发展成活动性结核病，在HIV感染者中该比率可高达10%～15%[11]，具体表现为MTB的痰培养或抗酸杆菌(AFB) 涂片阳性，胸片特征性表现和结核病症状如持续咳痰、发热、体质量下降等。活动性结核病临床症状和影像学特征明显，且具有较强的传播能力，健康者可吸入其咳嗽或喷嚏的飞沫而引发新一轮的结核感染和流行。

作为以飞沫核传播为主的肺结核，MTB以气溶胶的形式进入肺泡后，巨噬细胞和树突状细胞可以分别通过固有吞噬受体和模式识别受体 (PRRs) 来识别MTB，进而刺激宿主的免疫应答[12]。经处理的结核抗原由主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)Ⅱ处理呈递给CD4+T细胞，由MHCⅠ呈递给CD8+T细胞, 以启动适应性免疫应答[7]。活化 CD4+T 细胞是根据细胞因子分泌的不同被分成不同的功能亚群， 如 辅助性(Th)1、Th17、Th2 和调节性T 细胞 (Treg)。 活化 CD8+T 细胞成为细胞毒性 T 淋巴细胞 (CTLs) 通过颗粒胞吐作用和凋亡杀死感染细胞。免疫高峰期过后，大多数活化效应 T细胞凋亡, 只有少数发展成记忆 T 细胞 (Tm)[7]。以兔为模型的研究表明，MTB感染的严重性与带菌的颗粒大小呈现负相关[13]，小的颗粒可以深入肺下部；在肺上部，一些共生菌已经表达的病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)通过Toll样受体信号(Toll-like receptor, TLR)通路招募巨噬细胞等固有免疫细胞，可以清除MTB。而在肺下部，PAMPs会被MTB表面的巯基乙酸二甲酯(phthiocerol dimycocerosates，PDIM)封锁而不能发挥机体的清除作用，使MTB更易感染人体而致病[12]。感染期间，MTB首先感染抗原提呈细胞，包括巨噬细胞和树突状细胞。MTB可以表达酚糖脂，诱导其表面产生CCL2，因此可以招募和感染更多的依赖细胞表面趋化因子受体2(CCR2)的巨噬细胞和淋巴细胞，进一步形成结核感染的标志性病理结构——结核肉芽肿[12]。肉芽肿中心聚集有大量的中性粒细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)和大量的CD4+T细胞以及少量的CD8+T细胞，大量成纤维细胞聚集在外围[14]。大多数感染的人都存在肉芽肿的潜伏状态, 而一些可能发展成活动性肺结核与播散性肉芽肿。近期以斑马鱼为感染模型的研究发现，肉芽肿可以为MTB提供更多的氧气和营养来源，有利于其生长复制。在以鼠为模型的研究发现，结核肉芽肿起始于树突状细胞，然后招募巨噬细胞和中性粒细胞，该过程发生于适应性免疫启动之前。在有些动物模型中发现，结核肉芽肿内部严重缺氧，该现象与人体肉芽肿情况相一致，常因营养或氧缺乏而形成中心干酪样坏死[15]。

在人体内，MTB 差异区域(region of diffe-rence-1, RD-1)编码Ⅶ型分泌系统(type Ⅶ secretion system，T7SS；或称ESX分泌系统)-1刺激宿主表达基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase 9, MMP-9)以吸引巨噬细胞到感染部位形成肉芽肿[16]。招募的巨噬细胞吞噬入侵的MTB，并分泌促炎细胞因子和趋化因子，然后中性粒细胞聚集到该部位，通过还原型辅酶Ⅱ(NADPH)氧化酶依赖机制杀灭MTB[17]。当中性粒细胞清理失败时，巨噬细胞会将MTB内化处理，进一步激活T细胞、NK细胞等。淋巴结引流区的树突状细胞也会激活CD4+T细胞和CD8+T细胞。CD4+T细胞是被招募最快的主要细胞类型，它们围绕在由巨噬细胞和抗原提呈细胞聚集形成的结核性肉芽肿中心。部分CD8+T细胞也被招募到肉芽肿的周围，最外面是由成纤维细胞和其他的细胞外基质成分组成[18]。

结核性肉芽肿通常被认为是对宿主的一种保护机制，因其将MTB局限化，使其不能感染邻近组织，当宿主可以成功控制感染时，肉芽肿会脱水钙化[19]。在大多数患者中，MTB会在与宿主的抗争过程中达到一种平衡状态，即为潜伏感染。这种潜伏感染状态是不稳定的，可以被HIV感染、寄生虫感染等外源性感染或者营养不良等免疫功能不足激活。在这种情况下，MTB会迅速繁殖，引起肉芽肿崩裂，使病原菌得以在体内播散。有研究表明，肉芽肿实际上由MTB诱导形成，并有利于病原体的扩散[20]，因为肉芽肿诱导形成的血管可以为MTB提供生长复制的氧气和营养。肉芽肿的形成是病原体和宿主相互作用的动态过程，肉芽肿在结核病的发生、发展和转归过程中扮演了双重角色。从一定程度上讲，肉芽肿的发展和转归决定着结核病的病程和感染的最终结果[20]。

结核病是由MTB感染后引发的宿主慢性肉芽肿及其延续的免疫反应所介导的。MTB的感染可能导致不同的感染结果，但究竟何种因素决定了MTB感染结果还不得而知。在恒河猴感染模型中，多个基因型的MTB混合后感染同一宿主，不同的结核病灶常常由不同基因型的细菌诱导形成。即使是同一个菌株感染同一个宿主，在肺脏的不同部位的感染结果也不尽相同。目前的研究结果认为，感染结果与感染部位的微环境尤其是适应性免疫应答的杀伤速度相关[21]，MTB成功感染机体，形成的肉芽肿内部也具有各自不同的微环境和免疫平衡，从而最终决定了感染状态和疾病走向。据此可知，基于免疫微环境的研究，势必利于更好地了解MTB感染的最终结局和免疫机制的相关性，为靶向化疗药物的开发研制奠定理论基础。

努力提高结核病诊断与预后判断的研究

结核病患者的发现方式主要分为被动发现和主动发现。被动发现是指患者出现结核可疑症状后主动到相关医疗机构就诊，此为一项经常性的患者发现手段。主动发现主要是指卫生主管部门医疗保健单位组织针对人群开展的与肺结核有关的医学检查，包括普查和重点人群检查。由于普查的成本-效益较低，一般多采用重点人群筛查。重点人群主要包括肺结核患者的密切接触者、糖尿病患者、既往结核病患者、肿瘤患者、HIV感染者以及疑似肺结核症状者等。在结核潜伏感染阶段，患者无明显临床症状和体征，临床多通过TST和(或)IGRA进行诊断，当发展为活动性结核病时，可表现为痰AFB涂片和培养阳性，胸片特征样改变，以及诸如咳嗽、咳痰、低热、盗汗、体质量下降等临床表现。

结核病的实验室诊断方法主要包括细菌学、免疫学、分子生物学检查。传统的细菌学诊断主要通过痰涂片染色镜检和培养，但涂片镜检的敏感度低，导致该方法的临床漏诊率较高。李强等[22]研究发现抗酸杆菌自动荧光染色和显微镜扫描技术在检测MTB的敏感度和特异度较高，可作为传统的涂片镜检检测的替代工具。在诊断中一贯作为金标准的痰培养也因前处理繁琐、培养耗时长、易污染等因素常延误结核病的诊断和治疗。随着分子生物学的发展，以核酸扩增为基础的检测方法相继建立，如：美国Cepheid公司开发的集痰标本处理、DNA提取、核酸扩增、利福平耐药rpoB基因突变检测为一体的全自动分子诊断方法，GeneXpert MTB/RIF具有较高的敏感度和特异度[23]。金法祥等[24]研究以MGIT 960 液体培养作为诊断的金标准证实了GeneXpert MTB/RIF临床应用及推广价值。环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)使用多个特异引物和一个链置换酶实现PCR反应在恒温条件下快速进行，大大提高试验效率和降低实验室成本[25-26]；实时荧光恒温扩增(simultaneous amplification and testing，SAT)将新一代恒温扩增与实时荧光检测技术相结合，可准确鉴定MTB与非结核分枝杆菌，聂晓平等[27]评估了该技术对肺外结核病的临床诊断价值，发现SAT具有操作方便快速、检出率高、敏感度和特异度均较高的优势。但该技术也存在微量污染、假阳性等问题，因此，应严格操作规范、减少假阳性产生[28]。免疫学检测方法主要有结核菌素试验(PPD)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)等。由于受接种卡介苗的影响，PPD试验的特异度较低；ELISA主要用于检测血清中的特异性抗体，由于分枝杆菌种属间存在共同抗原决定簇以及抗原性较弱等原因，该方法的敏感度和特异度偏低[29]，但有研究发现基于MTB特异性分泌蛋白MPB64建立的ELISA方法具有高敏感度[30]；T-SPOT.TB 是由酶联免疫斑点技术发展而来，通过检测γ-干扰素水平，判断是否具有针对MTB特异性的T细胞反应，其敏感度和特异度较高，但存在结果易受到干扰、操作复杂、耗材相对昂贵等缺陷[31]。刘浩然等[32]研究发现通过检测胸腔积液中巨噬细胞迁移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)水平对肺结核和肺癌有一定的鉴别诊断作用。目前，实验室检查可采用多种检测方法联合应用，以期达到优势互补、提高检出率的目的。

注重循证决策，不断深入开展对结核病防治重点及难点问题的研究

近年耐多药结核(multidrug-resistant tuberculosis, MDR-TB)和广泛耐药结核(extensively drug-resistant tuberculosis, XDR-TB)的出现以及HIV与MTB双重感染给结核病的预防与控制工作带来了巨大的挑战[23, 33]。其中，治疗方案不合理、患者依从性差以及宿主免疫损害增多等因素是导致耐药结核病产生的主要原因[34]，当然，原发性耐药MTB菌株的传播也是不容忽视的重要原因[35]。耐药结核病病程长、死亡危险大、传染期长，增加了耐药结核病传播的机会，并使总体人群暴露于耐药MTB的危险之中。同时，HIV与MTB双重感染是艾滋病及结核病防治工作的重点，结核病是HIV感染者最常见的机会性感染和主要死因之一，两者感染的发生密切相关[33]。HIV的感染一方面加快了MTB感染者发展为活动性肺结核患者的进程，另一方面，HIV感染破坏了患者机体的免疫系统，致使机体对MTB的抗原应答能力严重受限，增加了机体对MTB的易感性，也加大了结核病内源性复燃或外源性再感染的风险。此外，一旦结核病患者感染了HIV，也会使结核病病情迅速发展，两者互相促进，加速病情恶化[11]。

MTB与宿主的相互作用是一个动态的演化过程，结核感染的进程和最终结局与宿主和病原体的因素均密切相关。此外，结核病是一种古老的疾病，在长期的与人类抗结核感染的斗争中，也不断发生着基因的演变和进化，进而出现了MDR-TB和XDR-TB ，给结核病的防控工作带来巨大挑战。目前，结核病完全防治的实现仍是一个世界性的医疗难题。其防控工作不仅要注重对结核病诊断和治疗，更要加强对结核病防治的科学研究。将宿主、病原菌以及环境3个要素有机结合起来，充分融合当代先进分子生物学技术，加强国内外战略资源共享，同时注重对结核病疫苗、诊断和治疗药物的研究，从三级预防策略着手，以期达到科学、高效防控结核病，为实现2035年终止结核病流行的战略目标做贡献。