GeneXpert MTB/RIF检测内科胸腔镜活检组织研磨悬液诊断结核性胸膜炎的价值

李成俊 孙炳奇 孙娇 张威 王洋 吉利 马方

结核性胸膜炎是造成胸腔积液的主要病因，在结核病高流行地区，约50%的胸腔积液由结核性胸膜炎引起[1-2]。由于结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)是导致结核性胸膜炎的直接原因，因此直接的病原学证据是诊断结核性胸膜炎的金标准。但是我国结核性胸膜炎患者胸腔积液中分离到抗酸杆菌的阳性率不足5%，MTB培养[包括BACTEC MGIT 960分枝杆菌液体培养(简称“MGIT 960培养”)和罗氏固体培养]的阳性率也仅为10%～20%，且培养时间需要4～8周，不利于临床及时诊断和治疗[3]。

新型核酸扩增分子检测方法——GeneXpert MTB/RIF(简称“Xpert”)全自动检测系统以全自动半巢式实时PCR技术为基础，以rpoB基因为靶基因，可在2 h内同时检测MTB和对利福平是否耐药[4]，该方法于2010年由WHO推荐用于肺结核的诊断[5]，2013年WHO又推荐其用于肺外结核的诊断[6]。但是近期有文献报道，胸腔积液中Xpert检测MTB的阳性率仅为12.5%～15.4%[3, 7]，因此，依靠胸腔积液Xpert 检测确诊结核性胸膜炎不能满足临床需要。本研究采用内科胸腔镜直视下胸膜活检组织标本研磨后的悬液行Xpert检测，试图评价该方法在结核性胸膜炎诊断中的应用价值。

资料和方法

一、研究对象的选择

1. 研究对象：收集2017年1月1日至12月31日在沈阳市胸科医院胸膜炎病房住院的行内科胸腔镜检查的不明原因胸腔积液患者51例。其中男27例，女24例；年龄19～65岁，平均(35.2±14.1)岁。51例患者入组标准为彩色超声检查显示单侧或双侧胸腔积液，积液深度>3 cm，未经过抗结核药物治疗，未进行胸腔穿刺术，一般状态可耐受内科胸腔镜操作，HIV检测阴性。所有患者临床资料完整，检查前均签署知情同意书。

2. 结核性胸膜炎诊断标准： 以胸腔积液或胸膜活检标本通过涂片或培养找到MTB作为结核性胸膜炎病原学确诊标准，以胸腔组织标本病理检查找到干酪性肉芽肿及抗酸染色阳性作为结核性胸膜炎病理学确诊标准[8]；以胸膜组织病理学检查明确为恶性肿瘤作为恶性胸腔积液诊断标准。

二、方法

1. 主要设备：可弯曲式电子胸腔镜(型号LTF-240，日本Olympus公司)、胸腔镜专用一次性软性套管、活检钳、胸腔闭式引流瓶等。

2. 检查方法：彩色超声定位确定手术切口，常规消毒、铺巾后，以5 ml 2%的利多卡因注射液沿肋间逐层浸润麻醉至胸膜，沿肋间切开约1.0 cm长的切口，用止血钳分离皮下组织至胸膜腔，将胸腔镜套管从切口垂直插入胸腔直至有突破感后，拔出针芯，将电子胸腔镜沿套管送入胸腔，扫视胸膜腔，手控负压(胸腔镜自带负压吸引功能)吸出胸腔积液，观察脏、壁层胸膜表面情况，摄取照片保存；同时在壁层胸膜多点取病灶组织送结核病实验室和病理科检查以协助诊断，操作结束后放置闭式引流管至恰当位置，观察有无出血，缝合切口。

3. 标本处理：所有患者胸膜活检组织标本均分为两部分，一部分进行病理检查：以4%甲醛固定，石蜡包埋，切片进行抗酸染色及苏木精-伊红染色；另一部分进行MTB病原学检查：将直径为6 mm的无菌陶瓷珠放入2 ml的美国MP FastPrep-24 样品处理系统样品管中，再将切碎后的标本加入样品管，随后加入0.5～1.0 ml的0.9%氯化钠注射液，拧紧盖子后将样品管安装到MP FastPrep-24MP均质破碎仪上(美国MP Biomedicals公司)，按组织的坚韧度等调节设置按钮，采用频率为6.5 m/s，设置时间标准为20 s，一般组织振荡2～3次即可。制成的悬液分别进行MGIT 960培养及 Xpert 法检测。

4. Xpert检测[9]：取1 ml按上述方法处理完毕的标本放置于有螺旋盖的标本前处理管中，加入2 ml 标本缓冲液，旋紧盖子在旋涡振荡器上振荡15～30 s，室温静置15 min，使标本充分液化。吸取2 ml液化的标本至Xpert 反应试剂盒，置于Xpert检测系统(美国Cepheid公司)模块，仪器开始自动化检测。约2 h反应结束后，在检测系统窗口下可直接观察测试结果。Xpert用5条分子信标探针将81 bp的利福平耐药核心区间(RRDR)以全部覆盖的方法进行检测，第6条探针作内对照。当样品中不存在MTB时，分子信标探针无法与目标序列配对结合，分子信标仍然呈茎环结构，5条探针均无荧光释放，而只有作为内对照的探针被检测出来，结果判为MTB阴性。当样品中存在对利福平敏感的MTB时，5条分子信标探针特异性地与目标靶序列配对结合且均释放荧光，结果判定为MTB阳性，且无利福平耐药。当样品中存在对利福平耐药的MTB时，目标靶序列上某个位点产生突变，5条分子信标探针中的1条或者几条不能很好地与之结合，仪器检出少于5条探针，结果认为MTB为阳性且对利福平耐药。

5. MGIT 960培养(美国BD公司)：取2 ml处理后的标本用于培养，严格按照操作说明进行前处理，培养时间设定为42 d。仪器自动报告阳性后，取培养液涂片镜检，查到抗酸杆菌并经菌种鉴定，以确定为MTB作为阳性结果，未见抗酸杆菌为阴性结果。对阳性菌株进行利福平、异烟肼、链霉素和乙胺丁醇的药物敏感性试验(简称“药敏试验”)，检查耐药情况。

三、统计学处理

采用SPSS 16.0软件进行统计学分析，计数资料采用“率(%)”表示，其中3种检测方法阳性检出率的一致性比较采用Kappa检验，Kappa值>0.75表示一致性较好，Kappa值<0.4表示一致性较差；3种检测方法敏感度的比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、不同检查方法诊断结核性胸膜炎的阳性检出率比较及患者确诊情况

以MGIT 960培养阳性，且菌种鉴定为MTB作为病原学确诊标准，20例患者确诊为结核性胸膜炎，阳性检出率为39.2%(20/51)；以胸膜组织活检病理肉芽肿性病变并抗酸染色阳性作为病理学诊断标准，17例患者确诊为结核性胸膜炎，阳性检出率为33.3%(17/51)；51例患者中共有34例最终确诊为结核性胸膜炎(MGIT 960培养与病理确诊患者中有3例重叠)，其余17例诊断为非结核性胸腔积液，其中病理检查证实恶性肿瘤13例，非特异性炎性胸腔积液4例。51例患者中22例 Xpert 检测为阳性，阳性检出率为43.1%(22/51)。MGIT 960培养和Xpert 法阳性检出率比较，Kappa=0.76，两者具有良好的一致性；但是MGIT 960培养与病理检查阳性率比较，以及Xpert 法与病理检查阳性率比较，Kappa值分别为0.31和0.11，说明两种病原学检查方法与病理检查方法一致性均较差。

二、Xpert诊断结核性胸膜炎的价值

以最终诊断结果为金标准，Xpert 法检测的敏感度和特异度分别为64.7%和100.0%，MGIT 960培养法检测的敏感度和特异度分别为58.8%和100.0%，病理检查的敏感度和特异度分别为50.0%和100.0%；Xpert 法检测的敏感度高于MGIT 960培养法和病理诊断，但差异无统计学意义(χ2=1.53，P=0.466)。通过MGIT 960培养确诊的20例患者中，18例Xpert检测结果为阳性，通过病理检查确诊的17例患者中，6例Xpert检测结果为阳性(3例重叠的患者中有2例Xpert检测结果为阳性)。具体见表1。

三、耐药情况检测

MGIT 960培养阳性的患者中，5例患者的标本检测出耐药菌株，其中单耐链霉素1例、单耐利福平1例、耐异烟肼+利福平1例、耐异烟肼+链霉素1例、耐异烟肼+链霉素+乙胺丁醇1例，其中耐利福平共2例；Xpert检测阳性患者中，2例对利福平耐药，两种检测方法之间利福平耐药患者无交叉。34例患者耐药率为20.6%(7/34)。

注 敏感度(%)=真阳性例数/(真阳性例数+假阴性例数)×100%；特异度(%)=真阴性例数/(真阴性例数+假阳性例数)×100%；阳性预测值(%)=真阳性例数/(真阳性例数+假阳性例数)×100%；阴性预测值(%)=真阴性例数/(真阴性例数+假阴性例数)×100%

讨 论

结核性胸膜炎是由于MTB感染，胸膜对MTB菌体成分产生迟发型变态反应而发生的炎症，部分患者表现为咳嗽、发热、胸痛甚至呼吸困难，以及出现少量至中等量胸腔积液，少数患者可出现大量胸腔积液。胸腔积液抗酸染色和培养发现MTB是诊断结核性胸膜炎的金标准，但是找到病原菌十分困难，其主要原因为[10]：(1)大多数情况下胸腔积液中不含有MTB，其产生是由于MTB的代谢产物或炎症因子刺激所致；(2)即使有MTB进入胸腔积液中，因其含量低，积液量大，MTB被稀释，现有方法学的局限性使其不易被检出；(3)形成脓性胸腔积液，标本处理和质量控制困难，MTB不容易被检测出来。即使是目前已经广泛应用的Xpert技术，在胸腔积液中检测到MTB DNA的阳性率也仅为12.5%～15.4%[3, 7]。因此，依靠胸腔积液细菌学阳性结果来诊断结核性胸膜炎是非常困难的。但是，如果患者不能得到早期的诊断和治疗，对患者的预后会有很大影响。

一、Xpert技术在国内外的应用情况

Xpert 技术是由美国Cepheid公司研发的一套半巢式实时荧光定量PCR体外诊断技术。近年来的多项研究表明，Xpert法对肺结核的诊断价值较高，刘旭等[11]研究显示，Xpert法对肺结核诊断的敏感度为90.4%(95%CI：89.2%～91.4%)，特异度为98.4%(95%CI：98.0%～98.7%)；王桂荣和黄海荣[12]应用Xpert 技术检测骨关节结核部位的脓液标本，敏感度为82%，特异度为100%；Bahr等[13]应用Xpert法检测脑脊液标本诊断结核性脑膜炎的敏感度达72.0%；陈禹等[9]报告Xpert检测HIV阴性泌尿系结核患者尿液标本的敏感度为64.4%，特异度为100.0%。尽管Xpert检测方法在痰、关节液、脑脊液和尿液标本中的敏感度非常高，但是Sehgal 等[14]对31项Xpert研究的Meta分析结果显示，21项研究以培养阳性作为“金标准”，Xpert检测对2167例结核性胸膜炎患者的汇总敏感度为51.4%；而10项研究以临床综合诊断为标准，Xpert检测对937例结核性胸膜炎患者的汇总敏感度仅为22.7%，无论是“金标准”还是综合诊断标准，其汇总特异度均在98%以上。因此，在现有的研究中，Xpert检测在结核性胸膜炎中的诊断价值非常有限。但是，尽管Xpert检测在结核性胸腔积液中的检测阳性率相比其他标本低，但是特异度接近100%，因此，其阳性结果理应被视为具有诊断价值[15]。

二、内科胸腔镜在不明原因胸腔积液诊断中的优势与不足

内科胸腔镜虽然是一种侵入性检查，但具有创伤小、操作简单、能够在局部麻醉下完成、观察视野清晰、安全有效等优点[16]。近年来在不明原因的胸腔积液诊断中越来越受到重视。Kong等[17]报道，经可视的内科胸腔镜活检，结核性胸膜炎的明确诊断率可达93.4%，Wang等[18]报道，833例不明原因胸腔积液患者应用内科胸腔镜检查，确诊率达92.6%，Agarwal等[19]采用Meta分析，对17项研究、共计755例不明原因的渗出性胸腔积液患者进行汇总分析，内科胸腔镜检查诊断的敏感度和特异度分别为91%和100%。因此，内科胸腔镜能在直视下进行诊断和治疗，更能在直视下取得理想的活检组织而获得准确率更高的诊断，相比闭式胸膜活检和胸腔积液的化验检查有更明显的优势。但是Amer 等[20]的研究报道，在确诊的结核性胸膜炎患者中，通过内科胸腔镜活检组织行病理学检查者只有53.8%表现为肉芽肿伴干酪样坏死的结核典型病变，董宇杰等[7]也报道仅有41.7%的病理组织学表现为结核典型病变。《中国结核病病理学诊断专家共识》[21]中指出，组织标本HE染色具有结核病基本病理变化并抗酸染色阳性者，仍需要MTB基因检测阳性方可确诊结核病，如果MTB基因检测结果为阴性，仅能提示性诊断结核病或者分枝杆菌病。近年来，基于核酸扩增技术的分子检测方法在石蜡包埋标本中应用广泛，但是MTB核酸荧光定量PCR法的检测阳性率仅为30.5%，Xpert技术对石蜡包埋标本进行检测则罕有报道[22]。因此，如何提高结核性胸膜炎的诊断准确率是一个亟待解决的问题。

三、内科胸腔镜胸膜活检组织研磨悬液进行Xpert检查在结核性胸膜炎诊断中的价值

本研究结果显示，胸膜活检组织研磨悬液进行Xpert检查的敏感度为64.7%，特异度为100.0%，阳性预测值为100.0%，阴性预测值为58.6%，明显高于文献[3]和[7]报道的检测阳性结果，证实此方法对提高结核性胸膜炎的诊断率有明确意义。在34例结核性胸膜炎确诊患者中，Xpert法检测阳性22例，MGIT 960培养法阳性20例，尽管两种检验方法阳性检出率一致性较好，且敏感度差异也无统计学意义，但是Xpert法仅需要2 h即可获得检验结果，而MGIT 960培养则需要2～3周才能获得检验结果，Xpert检测较MGIT 960培养法具有明显的时间优势。最新的《WS 288—2017肺结核诊断》[23]中已将胸腔积液MTB核酸检测阳性纳入结核性胸膜炎的确诊标准中。因此，胸膜活检组织研磨悬液Xpert检测阳性今后也可作为结核性胸膜炎的确诊依据，协助诊断并指导治疗。

四、初治结核性胸膜炎患者的耐药情况分析

MGIT 960培养阳性的患者中，5例患者标本检测出耐药菌株， Xpert检测阳性的患者标本中，2例对利福平耐药，二者之间并无交叉，34例确诊患者(均为初治)耐药率为20.6%。耐药顺序为利福平(4例，包括MGIT 960培养2例，Xpert检测2例)、异烟肼(3例)、链霉素(3例)、乙胺丁醇(1例)。两种检测方法耐药结果无交叉，可能与本研究样本数量较少、内科胸腔镜多位点(3～6个点)取材及取材样本量相对较少等有关。黄庆红等[24]报道265例结核性胸膜炎患者以痰标本和胸腔积液标本进行细菌耐药检测，在初治结核性胸膜炎患者中耐药率为30.1%，本研究结果低于上述报道，分析可能的原因为：(1)样本量较小；(2)排除了痰标本的耐药结果。因此，关于初治结核性胸膜炎患者耐药情况今后还有待于收集更多的临床资料进一步确证。

五、3种检测方法的比较

本研究所有患者经内科胸腔镜活检组织研磨悬液均同时做了2种病原学检测和活检组织病理学检查，3种方法在敏感度方面的差异没有统计学意义，在临床应用方面各有利弊：MGIT 960培养费用较低，可做多种药物的药敏试验，但是培养时间较长，不利于临床快速诊断及治疗；Xpert检测敏感度及特异度均较高，2 h内即可得到结果，同时可做利福平耐药检测，对临床指导意义较大，但是仅能做利福平单药药敏试验，对于耐多药或者多耐药患者不能及时发现，且费用昂贵；病理检查结果表现为典型的上皮细胞样肉芽肿性炎对结核性胸膜炎的诊断有指导意义，但是其对恶性胸腔积液的诊断却有着明显的优势，本研究51例患者中有13例经病理检查确诊为恶性肿瘤，对胸腔积液的鉴别诊断意义重大。为避免漏诊，胸膜活检多需要在3～6个位点进行取材，可能导致3种检查结果并不完全一致。因此，建议如果具备条件，3种方法同时进行检查，相辅相成，弥补不足，可以为临床医生提供更精准的诊断依据。

六、总结

内科胸腔镜活检组织研磨悬液进行Xpert检测在结核性胸膜炎诊断中具有以下优势：(1)在内科胸腔镜直视下取胸膜组织活检标本，准确率更高；(2)活检标本通过研磨后使标本液化，本研究选择了MGIT 960培养及Xpert检测方法，每家医院还可以根据自身的条件做抗酸染色涂片、罗氏分枝杆菌培养、荧光定量PCR检测、环介导等温扩增检测等检查项目，摆脱了标本形态学上的限制；(3)活检组织Xpert检测的阳性结果明显高于在胸腔积液中的阳性检测结果，对临床诊断意义更大。但由于本研究样本量偏小，同时受胸膜活检取材标本体积的限制，可能影响研究结果，在以后的工作中需要逐渐积累更多的患者资料；并引进海博刀系统等技术以提高活检标本取材的体积，减少偏差，以期得到更准确的研究结果。