BZR1基因表达模式分析

孙安南

摘 要：花药是被子植物产生雄性配子体的重要生殖器官，它的正常发育对植物的繁衍和传代非常重要。而植物生长发育的每一个阶段，从种子萌发到开花结果，都受到体内激素的调控。目前，包括生长素在内的六大植物激素及其相应的信号调控通路参与调控植物生长发育过程的功能和机制研究已经被广泛报道。其中，芸苔素（brassinosteroids， BRs）是植物中一种促进生长的甾体激素，在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中的相关遗传学研究奠定了BR在植物发育过程中的重要地位，BR合成以及信号传导通路的相关基因也被报道在植物营养生长、叶片发育、开花、光形态建成以及雄性生殖等过程中发挥重要作用。目前，这些基因参与调控花药发育背后的具体机制尚不清晰。我们通过运用mRNA原位杂交的方法分析了芸苔素信号通路中编码了转录因子的重要基因BZR1在拟南芥不同发育时期的花药中的表达模式，为BR信号通路调控雄蕊发育的机制研究提供了新的认识和重要的参考。

关键词：拟南芥；花药；芸苔素；BZR1；转录因子

中图分类号：Q789 文献标识码：A 文章编号：1671-2064（2017）23-0199-04

雄性生殖在开花植物繁衍传代的过程中发挥关键作用，对农作物的产量有重要的影响。雄性不育是指植物体中雄蕊发育由于受到内、 外因素的影响而发育不正常的现象，这种现象会严重影响作物产量。研究植物雄性生殖器官花药的正常发育过程以及揭示参与调控这一过程的重要基因的功能，对于我们通过遗传改良来增加粮食等作物的产量由重要的意义。

拟南芥植株小且产生的种子多，非常适合作为模式植物来进行遗传学研究。拟南芥是十字花科植物，拥有六个雄蕊，四长两短，四个较长的雄蕊被称为四强雄蕊。雄蕊由花丝和花药两部分组成。根据细胞形态学特征，前人将拟南芥花药的发育过程总共分成14个阶段：发育到第5期时，具有四角结构的花药原基孢子体细胞开始分化形成了由表皮層、内皮层、中间层、绒毡层，这四层体细胞包围小孢子母细胞形成了花药的典型的蝴蝶状结构。第6-7期，小孢子母细胞经过减数分裂形成单倍体小孢子的四分体，四分体被胼胝质层包裹。花药发育进入第8期时，胼胝质酶复合体降解了胼胝质层，小孢子从四分体中释放出来，孢粉素等物质随着绒毡层的降解，积聚到花粉母细胞表面，慢慢形成花粉壁。在第9到12期，经过两次有丝分裂，三核的花粉粒形成；此后，花药开裂，成熟花粉释放。

在拟南芥中，绒毡层是一层特殊的细胞层，该类细胞内含较多的RNA和蛋白质，并有油脂和类胡萝卜素等营养物质，为花粉粒发育提供了所需养料和信号分子。在花药的正常的发育中，绒毡层细胞分裂、分化成体细胞层，包围花粉母细胞（PMCs），绒毡层细胞的形成对成熟花粉的形成和释放有直接的作用，因此直接决定了雄蕊的育性，进而影响植株的雄性育性。在花药发育的第5期，各层细胞命运决定后，绒毡层细胞的超微结构与其他孢子体细胞并没有明显的差异。而在减数分裂期间，绒毡层细胞的细胞质则变得浓密，其中充满了核糖体、线粒体、内质网、高尔基体等等，显示其代谢高度活跃。减数分裂完成后，小孢子外的胼胝质在绒毡层分泌的胼胝质酶作用下降解，小孢子从四分体中释放出来并开始发育成熟，而绒毡层进一步特化为海绵状的细胞，分泌小泡释放小孢子发育所需要的蛋白质、脂类及其他营养物质。在花粉第一次有丝分裂完成 时，绒毡层细胞开始降解，细胞膜破裂，细胞残余与脂体释放到花粉表面成为对花粉粘着和信号识别很重要的花粉包被。

近些年国内外以拟南芥为材料，在花药发育过程中的分子调控机制研究取得了一定的进展，发现了多个雄性不育的突变体并克隆了相关基因，包括重要的转录因子如：DYT1、AMS和TDF1。DYT1在花药发育的第5期和第6期有较高的特异表达，dyt1突变体绒毡层细胞出现提前的异常空泡化，向药室内部挤压且无法顺利降解，生殖细胞不能发育形成成熟花粉粒。TDF1编码一个在绒毡层、减数分裂细胞以及小孢子细胞中高表达的转录因子，TDF1突变后，突变体花药的绒毡层细胞无法进一步分化并分泌胼胝质酶，从而导致小孢子母细胞的提前降解。AMS编码了对于花药绒毡层与减数分裂后小孢子发育至关重要的转录因子，在ams突变体中，绒毡层细胞在四分体被释放后出现空泡化，小孢子在四分体时期后逐渐降解。

芸苔素最早由Michelle于1970年发现，他从油菜（Brassica napus）花粉中提取出了一种能促进植物茎杆伸长和细胞分裂的高活性物质，将其称为芸苔素（brassinolide，BL），芸苔素可以强烈诱导细胞的生长和分化，此后，具有与BL相似结构和活性的甾体分子不断被发现，统称为芸苔素甾醇（brassinosteroids，BRs）。随后，在拟南芥中，大量BR 相关的突变体被发现，BR在发育中的功能也逐渐清晰。目前，我们已经研究证明了BR信号通路相关的基因参与调控植物营养生长、叶片发育、开花、光形态建成以及雄性生殖过程。BR被认为是广泛调控如细胞伸长、维管分化、根生长、对光的反应、抗逆、衰老等发育过程和生理过程的基本激素之一。这些基因除了编码了受体蛋白激酶的BR INSENSITIVE 1（BRI1）、编码拟南芥糖原合酶激酶3（GSK3）样激酶的BR INSENSITIVE 2（BIN2）等外，还包括编码转录因子的BZR1（BRASSINAZOLE RESISTANT 1）等。进一步的生物化学研究将这些组分整合起来，形成了一条连接从BR在细胞表面的感知到细胞核转录因子激活的磷酸化级联反应，即BR信号通路。

BR影响植物雄性育性，而BZR1是BR调控下游基因表达的关键转录因子，但目前并未有BZR1在花药发育过程中所发挥功能的研究报道。要了解基因功能，首先我们需要从目的基因的表达水平和模式研究入手，原位杂交（In situ Hybridization）是一种从细胞学角度研究基因表达水平和模式的有效的分子生物学技术，用原位杂交技术来探讨植物基因的时空表达研究是一种重要且成熟的研究手段。因此确定BZR1基因在不同发育时期的花药中的表达模式，可以为我们进一步了解BZR1在花药中可能发挥的分子功能提供线索，从而为从遗传上提高植物育性、增加作物产量提供一定的理论依据，无疑是必要且具创新性的。endprint

1 材料与方法

1.1 植物材料和植物培养

本研究所用到的拟南芥（Arabidopsis thaliana L.）野生型（Col-0）植株材料为哥伦比亚（Columbia）生态型背景。拟南芥植物种子点播在PH值为5.8的1/2MS培养基上，4℃处理48h后转入光照培养箱（16h光照8h黑暗），7天后将幼苗移栽至培养土中继续生长，温室的生长条件为：22摄氏度、湿度为65%、光周期为16h/8h（光/暗）。

1.2 植物总RNA的提取及反转录

首先取拟南芥花序，放入在1.5ml的离心管中，用液氮冷冻后研磨，待细胞组织破碎后加入1mL的Trizol试剂，剧烈震荡15秒，在室温静置15分钟。随后再加入200微升的氯仿，震荡混匀后静置2分钟，在4摄氏度以12000g转速离心15分钟，移取上层清液，转入新的1.5毫升的离心管中。加入等体积的异丙醇，颠倒混匀后，在-20摄氏度沉淀1小时。4摄氏度低温12000g 离心15分钟，弃上清，加入1mL 75%的乙醇清洗沉淀。7000g转速离心5分钟，去除上清溶液后开盖风干，加入适当体积的RNase-free水溶解RNA。

测量所提RNA溶液A260nm、A280nm吸光值，计算A260nm/A280nm以衡量总RNA纯度。

使用TAKARA公司的反转录试剂盒对RNA进行反转录。先使用gDNA Eraser酶在42摄氏度下消除所提RNA中混杂的基因组DNA。随后使用反转录酶于37摄氏度将RAN反转录成cDNA。

1.3 原位杂交探针的制备

在NCBI网站上搜索BZR1基因的cDNA序列，找到特异性高的序列区段（400bp）左右，针对这一序列设计探针引物。然后以拟南芥花序cDNA为模板，扩增探针序列，用T4连接酶连接至pGEM-T载体（Promega公司），连接产物转化大肠杆菌，使用氨苄抗性平板筛选阳性克隆，提质粒测序，测序结果正确者进一步进行质粒酶切（分别用Apa1酶和Spe1酶进行单酶切），酶切产物用SP6及T7转录酶分别进行转录，转录后的RNA产物经过纯化后即为反义及正义探针。

1.4 石蜡切片的制备

用RNase Free的FAA固定液对Col-0花序进行固定，讲过低温抽真空后，花序材料完全浸透于固定液中，换新鲜的FAA固定液后4摄氏度低温静置过夜。用50%、60%、70%、80%、90%、95%及100%的梯度浓度的酒精进行材料脱水处理，再用25%、50%、75%及100%的二甲苯梯度浓度溶液进行透明化处理，逐步加入蜡片，直至材料完全置入100%纯蜡中。包埋蜡块，并用石蜡切片机进行花序组织的切片。

1.5 原位杂交实验

对石蜡切片进行脱蜡覆水，在37摄氏度条件下用蛋白酶K对切片上的花序细胞组织的骨架蛋白进行消化，经过逐级脱水后每张片子加探针（50%甲酰胺，300mmoL/L NaCl，10mmoL/L Tris，1mmoL/L EDTA，1% Blocking Reagent），42摄氏度杂交过夜，次日依次用2×SSC溶液、0.5×SSC溶液、0.2×SSC溶液洗片，RNase消化30min，0.2×SSC溶液、PBS洗片，Blocking Reagent封闭1h，BSA封闭1h，抗-DIG-AP偶联二抗2h，NBT-BCIP显色，光镜下待显色程度合适后中止反应，封片观察，拍片。

2 实验结果

2.1 BZR1基因探针序列PCR

我们以拟南芥花序cDNA为模板，用正向引物（TCTAAGAACCCGAAACCGTT）和反向引物（TGTATCCTCTCTCCTTCCCAG）来对BZR1基因的特异序列进行PCR扩增。

PCR产物经电泳（图1），以Trans 2k plus（全式金公司）DNA marker为指示，可见大小为600bp左右，与目的片段大小一致。

2.2 转录探针的检测

用Roche公司的DIG轉录试剂盒进行BZR1基因的探针转录，正反义探针经过电泳检测，均显示出明亮的RNA条带（图2），证明探针合成过程正常，可用于原位杂交实验。

2.3 BZR1基因在花药绒毡层及花粉母细胞中特异表达

为了进一步明确BZR1基因在花药发育过程中的时空表达模式，本研究通过原位杂交的方法检测了该基因在花药4-12期的表达模式。

结果如图3所示。

BZR1基因从花药第5期开始在花粉母细胞和绒毡层中表达，信号持续至第8期开始减弱，随着绒毡层的降解，信号逐渐减弱，最后完全消失。BZR1在花药绒毡层及孢子母细胞中的表达模式暗示了其可能在花药发育过程中发挥重要作用。

3 讨论

原位杂交的结果显示BZR1基因在花药细胞中有表达，说明BZR1在其发育过程中可能发挥着重要的作用。BZR1基因表现出了较高的表达丰度，在花药发育中、晚期（5-9期）显示了一定的表达水平，且主要在绒毡层细胞中表达。绒毡层细胞对花药的发育至关重要，因此我们可以推测BZR1基因可能主要通过参与调控花药绒毡层细胞的发育来发挥其在雄性生殖方面的功能。

生命个体的遗传信息经历从DNA转录为RNA，再进一步翻译成各种功能蛋白的过程，最后执行相应的生物学功能。仅mRNA水平的表达分析无法反映基因在翻译水平的情况，因此，想要更多地了解BZR1基因参与雄性生殖过程的调控机制，在本研究的成果，还需要进行更为深入的蛋白质表达水平及功能分析。

参考文献

[1]Bedinger， P.A.， Hardeman， K.J.， and Loukides， C.A. （1994）. Travelling in style： the cell biology of pollen[J]. Trends Cell Biol. （4）， 132-138.endprint

[2]Blackmore， S.， Wortley， A.H.， Skvarla， J.J.， and Rowley， J.R. （2007）. Pollen wall development in flowering plants. New Phytol[J]. （174）， 483-498.

[3]Goldberg， R.B.， Beals， T.P.， and Sanders， P.M. （1993）. Anther development： basic principles and practical applications[J]. Plant Cell （5）， 1217-1229.

[4]Sorensen， A.M.， Krber， S.， Unte， U.S.， Huijser， P.， Dekker， K.， and Saedler， H. （2003）. The Arabidopsis ABORTED MICROSPORES （AMS） gene encodes a MYC class transcription factor[J]. Plant J. （33）， 413-423.

[5]Ye， Q.， Zhu， W.， Li， L.， Zhang， S.， Yin， Y.， Ma， H.， and Wang， X. （2010b）. Brassinosteroids control male fertility by regulating the expression of key genes involved in Arabidopsis anther and pollen development[J]. Proc. Natl. Acad. Sci. USA （107）， 6100-6105.

[6]Zhang， W.， Sun， Y.， Timofejeva， L.， Chen， C.， Grossniklaus， U.， and Ma， H. （2006）. Regulation of Arabidopsis tapetum development and function by DYSFUNCTIONAL TAPETUM1 （DYT1） encoding a putative bHLH transcription factor[J]. Development （133）， 3085-3095.

[7]Zhu， J.， Chen， H.， Li， H.， Gao， J.， Jiang， H.， Wang， C.， Guan， Y.， and Yang， Z. （2008）. Defective in Tapetal Development and Function 1 is essential for anther development and tapetal function for microspore maturation in Arabidopsis[J]. Plant J. （55）， 266-277.

[8]Zinkl， G.M.， Zwiebel， B.I.， Grier， D.G.， and Preuss， D. （1999）. Pollen-stigma adhesion in Arabidopsis： a species-specific interaction mediated by lipophilic molecules in the pollen exine[J]. Development （126）， 5431-5440.endprint