远志总皂苷对癫痫模型大鼠nAChRɑ7亚基表达的影响

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癫痫是由多种原因导致的脑部神经元高度同步化异常放电所致的临床综合征。癫痫的核心内容是癫痫发作，但30%～40%的癫痫病人除癫痫症状外，常伴有学习记忆减退，注意力分散等认知功能障碍表现[1]。迄今为止，癫痫对认知功能影响的机制仍未完全阐明，且缺乏有效的防治药物。胆碱能神经系统与注意力、学习和记忆等认知过程有关[2]。烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)广泛分布在海马、前额皮质等与认知功能密切相关的区域。烟碱型乙酰胆碱受体ɑ7(nAChRɑ7)是nAChR的一种重要亚型，广泛存在于中枢神经系统，可能在认知过程中发挥重要作用[3]。

远志是我国传统的安神益智良药，其中的远志总皂苷(Tenuigenin，TEN)被认为是其有效成分，在提高学习记忆方面有显著的作用，可通过降低胆碱酯酶活性，保护中枢胆碱能系统改善学习记忆[4-5]。前期实验证实TEN可改善癫痫模型大鼠空间学习记忆能力及海马LTP的抑制[6]。本实验在前期实验基础上观察大鼠海马CA1区nAChRɑ7亚基表达的变化及TEN对其影响，探讨TEN改善学习记忆功能的部分可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 成年雄性Wistar大鼠，体重250 g～300 g，来源于北京海淀兴旺动物养殖场，室温(25.5±2)℃喂养。

1.1.2 药品、试剂及实验仪器 远志总皂苷(Tenuigenin，TEN)，纯度为72%，在山西大学中医药现代研究中心提取，取37.5 g溶于1 L的蒸馏水中，充分溶解后置于4℃环境保存；戊四氮(Pentylenetetrazole，PTZ)购于Sigma公司，将其溶于生理盐水配成1%的溶液(10 mg/mL)后置于4℃环境保存；SABC免疫组化染色试剂盒(羊抗兔IgG，SABC液，5%BSA封闭液)购于武汉博士德生物工程有限公司；兔抗大鼠nAChRɑ7购于北京博奥森公司。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物分组及造模 将32只雄性Wister大鼠随机分为对照组(8只)、模型组(12只)、TEN防治组(12只)。模型组每天腹腔注射致惊厥剂量的PTZ(40 mg/kg)，注射完观察大鼠2 h，记录发作分级、次数，根据大鼠体重进行剂量调节，连续给药28 d，停药7 d，再以相同剂量点燃，惊厥发作以Racine法分级标准进行判断，以连续2次以上、5级以上发作视为造模成功。TEN防治组在造模的同时灌服TEN溶液(375 mg/kg)，连续给药35 d，然后腹腔注射PTZ点燃。对照组则灌服等剂量的生理盐水。造模结果：对照组8只大鼠均存活；癫痫模型组12只大鼠癫痫发作死亡3只，未达标1只，造模成功8只；TEN防治组大鼠癫痫发作死亡2只，未达标1只，造模成功9只。

1.2.2 切片制备 采用7% 水合氯醛(3 mL/kg)进行腹腔麻醉，剪开胸腹腔，暴露心脏和肝脏，剪开左心尖及右心耳部，将导管插入左心室并固定，快速注入约250 mL生理盐水至肝脏完全变白，右心耳流出澄清液体后，再注入40 g/L 多聚甲醛固定液数分钟，待大鼠肝脏变硬、肢体僵直后断头，取出完整鼠脑并投入含4%的多聚甲醛中4℃固定(4～6) h，脱水，透明，石蜡包埋。冠状位连续切片，切片厚度为2 μm。

1.2.3 免疫组化染色 采用SABC(Strept Actividin-Biotin Complex)免疫组化染色法。①石蜡切片常规脱蜡；②PBS洗2 min×2 次，3% 的H2O2溶液，室温10 min；③PBS洗2 min×2 次，加入枸橼酸缓冲液中于高压锅中煮沸2 min，冷却至室温；④PBS洗2 min×2次，滴加5% BSA 封闭液，室温30 min，甩去多余液体；⑤滴加稀释的兔抗大鼠nAChRɑ7稀释液(1∶50)，4 ℃ 过夜；⑥ 复温40 min，PBS 冲洗2 min×2次；⑦滴加生物素化山羊抗兔IgG，37℃ 30 min，PBS洗2 min×2次；⑧滴加SABC，37℃ 20 min，PBS 洗2 min×3 次；⑨ DAB 显色，(7～8) min后蒸馏水终止显色反应；⑩苏木素复染11 s。脱水，封片。光镜下观察。

1.2.4 阴性对照的建立 以10% PBS 代替一抗，其余步骤同前。

1.2.5 灰度值测定 应用美国aperio公司Scanscope数字病理扫描系统，400倍物镜下，在相对应的海马CA1区内，随机各取5个视野，测单个视野中nAChRɑ7的灰度值。

2 结 果

各组海马CA1区nAChRɑ7亚基免疫组化结果见图1，免疫染色阳性物质主要存在于神经元细胞表面。其中对照组细胞密集、免疫染色深；模型组细胞稀疏、免疫染色淡，其平均灰度值显著大于对照组(P<0.05)；TEN防治组免疫染色阳性细胞较密集，染色较深，其平均灰度值显著小于模型组(P<0.05)。详见表1。

图1 各组海马CA1区nAChRɑ7表达免疫组化结果

表1 各组海马CA1区nAChRɑ7表达的平均灰度值(±s)

3 讨 论

癫痫后继发认知功能损害的现象已逐渐引起广泛重视，但目前癫痫对认知功能影响的机制仍未完全阐明，且缺乏有效的防治药物。胆碱能假说认为胆碱能突触是一种记忆突触，与学习记忆过程密切相关[7]，乙酰胆碱释放减少或乙酰胆碱受体数目减少会导致认知功能障碍。烟碱型乙酰胆碱受体ɑ7(nAChRα7)是烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)的重要亚型之一，由5个相同的α7亚基构成，属于配体门控离子通道，广泛分布于海马、下丘脑、皮质下基底核等部位，可能在认知过程中发挥重要作用[3， 8]。研究表明缺乏nAChRα7的小鼠存在认知能力减退[9]，而使用烟碱或其他nAChRα7激动剂可改善认知功能，改善学习、记忆功能[10]。

远志在临床上的应用历史悠久，具有改善认知能力的功效，TEN作为其主要成分，对学习记忆影响也日益受到重视[10]。TEN可改善癫痫模型大鼠空间学习记忆能力及海马LTP的抑制[6]。本实验在此基础上观察大鼠海马CA1区nAChRɑ7亚基表达的变化及TEN对其影响，结果提示TEN能够提高癫痫模型大鼠海马CA1区nAChRɑ7表达。TEN可显著提高癫痫模型大鼠海马CA1区NMDA 受体的表达[11]。

TEN可改善癫痫模型大鼠空间学习记忆能力及海马LTP的抑制，其可能是通过提高癫痫模型大鼠海马CA1区NMDA受体和nAChRɑ7的表达起到改善癫痫模型大鼠认知障碍的作用，该系列研究结果为临床研制新药提供了理论依据。

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