鱼类母源性免疫和免疫增强剂的跨代免疫作用❋

张士璀, 张 钦, 蒋成砚

(中国海洋大学海洋生命学院，山东 青岛 266003)

鱼类养殖在我国乃至世界水产养殖业中都处于支柱产业地位，因此一直倍受重视。然而，鱼类养殖业特别是海水鱼类养殖业的发展也存在一些亟待解决的问题。随着养殖规模不断扩大，对鱼苗需求量也大大增加，而与此形成鲜明反差的是鱼类育苗期，胚胎和仔稚鱼死亡率通常较高，已经成为长期困扰海水鱼类养殖业发展的一个关键问题。例如，即使在人工养殖(没有天敌/鱼类捕食)条件下，鱼苗死亡率有时也高达90%以上[1]，严重影响鱼苗生产，致使生产效益下降、成本增加，这已经成为鱼类苗种培育生产中一个亟待解决的难题[1-3]。近年来，有关于鱼类母源性免疫和免疫增强剂跨代免疫功能的研究报道，为解决这一养殖难题提供了可能。本文对近年来有关研究进展作了简要概述。

1 病害乃鱼类胚胎和仔稚鱼死亡重要原因之一

鱼类早期胚胎和仔稚鱼高死亡率，长期以来是鱼类生活史研究领域中的一个中心问题。鱼类的发育从受精卵开始，历经胚胎发育期、仔鱼期、稚鱼期，直至发育到幼鱼期结束。在早期发育过程中，鱼类的营养方式由内源性营养向外源性营养转变，同时器官和相应生理功能逐渐发育完善。在自然条件下，鱼类早期发育过程中仅有不到1.0%的个体能够存活下来[1]。自然条件下影响鱼类成活率的主要因素有饵料丰富程度、天敌和水文环境优劣等。然而，在人工养殖条件下，上述影响成活率因素几乎被调控于最佳状态，水温、光照、盐度等理化环境适宜，有轮虫、卤虫等组成的充足饵料，并且没有捕食生物存在，但养殖鱼类早期阶段死亡率依然很高。目前，普遍认为养殖条件下影响鱼类胚胎和仔稚鱼成活率的主要因素是卵子质量和卵子成熟度[3]。另一方面，越来越多证据表明，绝大多数鱼类赖以生存、发育的水环境中存在大量各种各样微生物，其中不乏一些致病细菌，可以在受精数小时后就黏附到并生活于卵子表面，成为鱼类早期胚胎死亡重要原因之一[2-3]。例如，毛霉亮发菌(Leucothrixmucor)黏附到鳕鱼卵子表面后，可以导致大量胚胎死亡；嗜冷嗜纤维菌(Cytophagapsychrophilum)可以感染虹鳟和鲑鱼胚胎，导致冷水病的发生。某些病原还可以在鱼类垂直传播，影响胚胎发育。例如，传染性造血坏死病毒(Infectious hematopoietic necrosis virus, IHNV)可以从虹鳟鱼亲代传递给子代，导致胚胎急性病并大量死亡[4]。同样，在包括广东省在内的我国南方广大地区大量养殖的重要鱼类石斑鱼中，神经坏死病毒也可以从亲代传递给子代，并引起鱼苗发病[5]。因此，卵子质量和疾病感染都是早期鱼类死亡重要原因。需要指出的是，卵子和胚胎抗病力是卵子质量的一个重要标志，与胚胎抵抗病原攻击的能力直接相关。

2 免疫分子从亲代传递给子代为胚胎提供免疫保护

绝大多数鱼类体外受精，胚胎在体外发育，这与哺乳类在母体内发育并得到母亲很好保护完全不同。特别是鱼类胚胎的免疫系统发育相对较晚，基本不具备或者仅有些许合成免疫相关分子的能力[6-7]。因此，鱼类胚胎主要依靠从亲代(母体)传递来的免疫相关物质(分子)，比如免疫球蛋白IgM和溶菌酶等，保护其不受病原感染[8]。

母亲通过胎盘、初乳、乳汁(哺乳动物)或者卵子(卵生动物)传递给子代的免疫能力被称为母源性免疫，这被认为在保护脆弱的子代免受病原攻击中发挥关键作用。早在110多年前，在哺乳类和鸟类就出现了关于母源性免疫的描述，以后又发现免疫球蛋白可以由亲代向子代传递[9]。 现在母源性免疫已经在包括哺乳类、鸟类、爬行类、两栖类和鱼类在内的脊椎动物中以及包括昆虫、虾和文昌鱼(Branchiostomabelcher)在内的无脊椎动物中得到证明[10-11]。

对鱼类母源性免疫的研究远比对哺乳类和鸟类母源性免疫的研究起步晚。鱼类胚胎外围包裹有受精膜，既可以起到缓冲作用保护胚胎免受机械损伤，又可以在一定程度上不让微生物进入内部，保护胚胎不受病原感染。但是，真正对鱼类胚胎起关键保护作用的主要是依靠从亲代传递给子代的免疫相关分子，比如免疫球蛋白IgM、溶菌酶和补体成分等[7]。在1980年代，在蝶鱼卵子中首先发现有IgM存在[11-12]，以后又陆续在鱼类卵子中发现一些其他母源性免疫因子。在已经发现的鱼类各种母源性免疫因子之中，对免疫球蛋白的研究较为集中和深入。目前，已经在数种鱼类卵子中发现有IgM，包括鲤鱼(Cyprinusmajor)、罗非鱼(Oreocnromisspp)、真鲷(Pagrosomusmajor)、鲈鱼(Lateolabraxjaponicus)、虹鳟(Salmogairdneri)、鲑鱼(Oncorhynchustschawytscha)、鲽(Pleuronectidae)和斑马鱼(Daniorerio)等[13-15]。然而，关于鱼类卵子中IgM的功能研究仅见于Swain等、Hanif等和Wang等的报道[13,15-16]，他们从不同角度分别证明鱼卵中的IgM可能对正在发育的胚胎具有免疫保护作用。关于免疫球蛋白在亲子之间的传递机制，Swain等认为和胎生脊椎动物的传递机制相似，也是通过受体介导的跨膜作用进入卵子中。还有一种观点认为，鱼类繁殖期血液中的免疫球蛋白含量显著升高；由于血液中免疫球蛋白浓度高于卵泡，因此亲鱼循环系统的免疫球蛋白便可以通过血液循环而进入卵泡。进入卵子的母源性免疫球蛋白在早期发育过程中，会随着胚胎或仔鱼的体液(或血液)循环从卵黄囊进入其他各个器官，逐渐被代谢消耗并在此过程中发挥识别并结合抗原的活性作用，从而使仔鱼保持较高的存活能力。

除去适应性免疫分子IgM之外，鱼类的补体成分、溶菌酶、凝集素和蛋白酶抑制剂等天然免疫成分都具有母源性免疫功能[13,17-20]。例如，虹鳟的补体成分C3、C4、C5和Bf能够传递给子代，鲤鱼和狼鱼(Anarrhichtysocellaus)的 C3也能够传递给子代。我们的研究也发现斑马鱼的替代补体途径关键因子C3和Bf可以从亲代传递给子代，并且利用建立的体外补体活性检测方法，证明斑马鱼卵内补体成分具有保护早期胚胎的功能[17-18]。我们还发现由卵黄蛋白原(Vitellogenin)降解产生的卵黄蛋白-高磷蛋白(Phosvitin)和脂磷蛋白(Lipovitellin)除了可以给胚胎提供营养之外，也参与鱼类胚胎免疫保护作用[21-23]。最近，有人报道白细胞的吞噬作用也在鱼类胚胎免疫保护中发挥一定作用[24]。这些结果都说明鱼类卵子中的确存在许多母源性免疫因子，它们都对早期胚胎的正常发育起到保护作用。

3 免疫增强剂可促进免疫分子亲子转移

免疫增强剂(Immunostimulant)是指具有增强免疫功能的生物活性物质。免疫增强剂种类很多，包括聚肌胞苷酸、左旋咪唑等化学合成物质，来源于微生物和动植物的多糖类以及人或动物免疫系统产生的激素和维生素类物质，还有一些中药的有效成分，如，刀豆蛋白A、胎盘多糖及植物血凝素等。其中，来源广泛(如植物、藻类、蘑菇和酵母等)的葡聚糖(β-glucan)和其他多糖等免疫增强剂，被认为是提高水产养殖鱼类免疫力的有效工具(Effective tool)，不但可以促进免疫相关分子合成，提高鱼体免疫力，增强机体抗病能力，而且已经在水产养殖生产中得到应用[25]。有证据表明，β-葡聚糖能与单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和自然杀伤细胞表面特异性受体结合，从而激活这些免疫细胞释放TNF-α、TGF-1β、IL-1β、IL-6、IL-10以及IL-12等细胞因子。在这些细胞因子的作用下，新的白细胞不断生成，诱导机体产生细胞免疫和体液免疫[26-28]，它们还可以促进吞噬细胞的吞噬活性和呼吸爆发活力[29-30]，同时可以促进溶菌酶、补体C3、C4、Bf等免疫因子分泌量增加[29,31]。除此之外，β-葡聚糖还能提高鱼体内抗体产生水平，提高其抗病毒感染能力[31-32]。总之，葡聚糖对成鱼鱼类的先天性免疫和特异性免疫都有促进作用。那么，β-葡聚糖是否可以促进母源性免疫因子从亲代向子代转移，从而提升鱼类胚胎的免疫能力呢？这是一个既具有理论意义又具有潜在应用价值的重要问题。

新近，我们发现用β-葡聚糖饲喂斑马鱼雌鱼，不但能够增强免疫相关分子C3、Bf和溶菌酶在斑马鱼卵中的含量，而且来自这些卵子的胚胎具有更强的抵抗细菌感染的能力，表明卵子内提高了的C3、Bf和溶菌酶直接参与斑马鱼胚胎发育的抑菌作用。但是，饲喂β-葡聚糖的斑马鱼与对照斑马鱼(未饲喂β-葡聚糖)比较，产卵量和胚胎发育孵化率均没有差异[33-34]。这些结果说明，β-葡聚糖可以安全有效运用于鱼类养殖，用来提高鱼类胚胎的非特异性免疫功能，达到提高鱼类育苗成活率的目的。目前，相关的生产试验已在鲆鲽鱼类上展开。

总之，随着鱼类养殖的不断发展，苗种培育变得越来越重要，如何提高鱼类苗种的质量和数量对鱼类养殖规模的扩大至关重要。除控制鱼卵质量、养殖环境等因素外，如何降低因疾病而造成的早期胚胎死亡率也不容忽视。葡聚糖能增强母源性免疫因子在卵子中的含量，提高胚胎免疫保护力，这给提高鱼类鱼苗成活率提供了一条可行途径。

参考文献:

[1] 李军, 肖志忠, 肖永双. 养殖鱼类早期发育阶段为什么死亡率高[M]. ∥吴常信. 10000个科学难题农业科学卷. 北京: 科学出版社，2011, 760-763.

Li J, Xiao Z Z, Xiao Y S. Why high mortality rate occurs in early developmental stages of cultured fish[M]. ∥Wu C X. 10000 Selected Problems in Science, Agriculture Sciences. Beijing: Science Press, 2011: 760-763.

[2] Brock J A, Bullis R. Disease prevention and control for gametes and embryos of fish and marine shrimp[J]. Aquaculture, 2001, 197(1-4): 137-159.

[3] Hansen G H, Olafsen J A. Bacterial interactions in early life stages of marine cold water fish[J]. Microb Ecol, 1999, 38(1): 1-26.

[4] Mulcahy D, Pascho R J. Adsorption of fish sperm of vertically transmitted fish viruses[J]. Science, 1984, 225(4659): 33-335.

[5] 林克冰, 方琼珊. 石斑鱼苗种期常见病害及其防治[J]. 福建水产, 2006, 4: 52-54.

Lin K B, Fang Q S. Prevention and treatment for common diseases in grouper larvae [J]. Journal of Fujian Fisheries, 2006, 4: 42-54.

[6] Magnadottir B, Lange S, Gudmundsottir S, et al. Ontogeny of humoral immune parameters in fish[J]. Fish Shellfish Immunol, 2005, 19(5): 429-439.

[7] 张士璀, 李欣, 汲广东. 鱼类免疫系统的早期发生[J]. 中国海洋大学学报， 2007, 37(4): 557-562.

Zhang S C, Li X, Ji G D. Ontogeny of fish immune system [J]. Periodical of Ocean University of China, 2007, 37(4): 557-562.

[8] 张士璀. 鱼类免疫因子的亲子传递及其对子代保护作用[M]. ∥吴常信. 10000个科学难题农业科学卷. 北京: 科学出版社，2011, 764-766.

Zhang S C. Transfer of Maternal immune-relevant factors from mother to offspring and their protective roles in fish [M]. ∥ Wu C X. 10000 Selected Problems in Science, Agriculture Sciences. Beijing: Science Press, 2011: 764-766.

[9] Erhlich P. Ueber immunität durch vererbung und säugung[J]. Z Hyg lnfectkt Krankn, 1892, 12(1): 183-203.

[10] Hauton C, Smith V J. Adaptive immunity in invertebrates: A strawhouse without a mechanistic foundation[J]. Bioessays, 2007, 29(11): 1138-1146.

[11] Zhang S C, Wang Z P, Wang H M. Maternal immunity in fish[J]. Dev Comp Immunol, 2013, 39(1-2): 72-78.

[12] Loon J J A V, Oosterom R V, Muiswinkel W B V. Development of the immune system in carp (Cyprinuscarpio)[J]. Aspects of Developmental and Comparative Immunology, 1981(1)： 469-470.

[13] Swain P, Dash S, Bal J, et al. Passive transfer of maternal antibodies and their existence in eggs, larvae and fry of Indian major carpLabeorohita(Ham)[J]. Fish Shellfish Immunol, 2006, 20(4): 519-527.

[14] Kanlis G, Suzuki Y, Tauchi M, et al. Immunoglobulin in oocytes, fertilized eggs, and yolk sac larvae of red sea bream[J]. Fish Sci, 2008, 61: 787-790.

[15] Wang H, Ji D, Shao J, et al. Maternal transfer and protective role of antibodies in zebrafishDaniorerio[J]. Mol Immunol, 2012, 51(3-4): 332-336.

[16] Hanif A, Bakopoulos V, Dimitriadis G J. Maternal transfer of humoral specific and non-specific immune parameters to sea bream (Sparusaurata)larvae[J]. Fish Shellfish Immunol, 2004, 17(5): 411-435.

[17] Wang Z P, Zhang S C, Wang G F, et al. Complement activity in the egg cytosol of zebrafishDaniorerio: Evidence for the defense role of maternal complement components[J]. PLoS ONE, 2008, 3(1): e1463. doi: 10.1371/journal.pone.0001463.

[18] Wang Z P, Zhang S C, Tong Z, et al. Maternal transfer and protective role of the alternative complement components in zebrafishDaniorerio[J]. PLoS ONE, 2009, 4(2): e4498. doi: 10.1371/journal.pone.00044982009.

[19] Løvoll M, Kilvik T, Boshra H, et al. Maternal transfer of complement components C3-1, C3-3, C3-4, C4, C5, C7, Bf, and Df to offspring in rainbow trout (Oncorhynchusmykiss)[J]. Immunogenetics, 2006, 58(2): 168-179.

[20] Ellingsen T, Strand C, Monsen E, et al. The ontogeny of complement component C3 in the spotted wolffish (Anarhichas minor Olafsen)[J]. Fish Shellfish Immunol, 2005, 18(5): 351-358.

[21] Wang S, Wang Y, Ma J, et al. Phosvitin plays a critical role in the immunity of zebrafish embryos via acting as a pattern recognition receptor and an antimicrobial effector[J]. J Biol Chem, 2011, 286(25): 22653-22664.

[22] Zhang J, Zhang S. Lipovitellin is a non-self recognition receptor with opsonic activity[J]. Marine Biotechnology, 2011, 13(3): 441-450.

[23] Sun C, Hu L, Liu S, et al. Antiviral activity of phosvitin from zebrafishDaniorerio[J]. Dev Comp Immunol, 2013, 40(1): 28-34.

[24] Rounioja S, Saralahti A, Ranatala L, et al. Defense of zebrafish embryos againstStreptoococcuspneumoniaeinfection is dependent on the phagocytic activity of leukocytes[J]. Dev Comp Immunol, 2012, 36: 342-348.

[25] Meena D K, Das P, Kumar S, et al. β-glucan: An ideal immunostimulant in aquaculture (a review)[J]. Fish Physiol Biochem, 2013, 39(3): 431-457.

[26] Chansue N, Endo M, Kono T, et al. The stimulation of cytokine-like proteins in tilapia (Oreochromisniloticus) orally treated with β-1, 3-glucan[J]. Asian Fish Sci, 2000, 13: 271-278.

[27] Secombes C J, Hardie L J, Daniels G. Cytokines in fish: An update[J]. Fish Shellfish Immunol, 1996, 6: 291-304.

[28] Hardie L J, Chappell L H, Secombes C J. Human tumor necrosis factor a influences rainbow troutOncorhynchusmykissleucocyte responses[J]. Vet Immunol Immunopathol, 1994, 40(1): 73-84.

[29] Ai Q, Mai K, Zhang L, et al. Effects of dietary β-1, 3-glucan on innate immune response of large yellow croaker,Pseudosciaenacrocea[J]. Fish Shellfish Immunol, 2007, 22(4): 394-402.

[30] Kumari J, Sahoo P. Non-specific immune response of healthy and immunocompromised asian catfish (Clariasbatrachus) to several immunostimulants[J]. Aquaculture, 2006, 255(1): 133-141.

[31] Misra C K, Das B K, Mukherjee S C, et al. Effect of long term administration of dietary β-glucan on immunity, growth and survival of labeo rohita fingerlings[J]. Aquaculture, 2006, 255(1): 82-94.

[32] Sealey W, Barrows F, Hang A, et al. Evaluation of the ability of barley genotypes containing different amounts of β-glucan to alter growth and disease resistance of rainbow troutOncorhynchusmykiss[J]. Animal Feed Science and Technology，2008, 141(1): 115-128.

[33] Jiang C Y, Wang P, Li M Y, et al. Dietary β-glucan enhances the contents of complement component 3 and factor B in eggs of zebrafish[J]. Dev Comp Immunol, 2016, 65: 107-113.

[34] Wang P, Jiang C Y, Liu S S, et al. Trans-generational enhancement of C-type lysozyme level in eggs of zebrafish by dietary β-glucan[J]. Dev Comp Immunol， 2017, 74: 25-31.