加味千金苇茎汤对大气细颗粒物致肺损伤大鼠肿瘤坏死因子—α和核因子—κB的影响

沈赵赟++符胜光++杨爱东++吴中华++李素云++帅玉叶++唐普仁

摘要：目的 觀察加味千金苇茎汤对大气细颗粒物致肺组织损伤大鼠肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和核因子-κB（NF-κB）的影响，探讨其可能的作用机制。方法 大鼠气管滴注15 mg/kg细颗粒物生理盐水混悬液造模，隔日1次，共3次。将32只Wistar大鼠随机分为正常组、模型组和加味千金苇茎汤高、低剂量组，每组8只，给药组每日给予相应剂量药物灌胃。ELISA检测支气管肺泡灌洗液TNF-α水平，免疫组化检测肺组织NF-κB蛋白表达，光镜下观察大鼠肺组织病理变化。结果 与正常组比较，模型组大鼠肺泡灌洗液TNF-α含量及肺组织NF-κB蛋白表达显著升高（P<0.01）；与模型组比较，加味千金苇茎汤低、高剂量组大鼠肺泡灌洗液TNF-α含量及肺组织NF-κB蛋白表达显著降低（P<0.05，P<0.01）。病理观察结果显示，模型组较正常组小气管内、肺泡及肺间质内有大量细颗粒物沉着，肺泡及肺间质内可见大量吞噬细颗粒物的巨噬细胞并伴有较多中性粒细胞和淋巴细胞浸润；加味千金苇茎汤高、低剂量组肺组织病理改变明显轻于模型组，高剂量组炎症反应较轻，肺泡及肺间质内可见吞噬细颗粒物的巨噬细胞、少量中性粒细胞和淋巴细胞浸润。结论 加味千金苇茎汤可能通过降低TNF-α含量、下调NF-κB蛋白表达，以减轻模型大鼠的肺组织损伤，对肺组织有保护作用。

关键词：加味千金苇茎汤；细颗粒物；肺损伤；肿瘤坏死因子-α；核因子-κB；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.01.009

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）01-0038-05

Effects of Modified Qianjin Weijing Decoction on TNF-α and NF-κB

in Rats with Lung Injury Induced by Particulate Matter

SHEN Zhao-yun， FU Sheng-guang， YANG Ai-dong， WU Zhong-hua， LI Su-yun， SHUAI Yu-ye， TANG Pu-ren Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 201203， China

Abstract： Objective To investigate the protective effect of modified Qianjin Weijing Decoction （MQJWJD） on TNF-α and NF-κB in rats with lung injury induced by particulate matter； To discuss relevant mechanism of action. Methods A tracheal drip 15 mg/kg fine particles of saline solution was used to establish modeling， every other day， three times. Thirty-two Wistar rats were randomly divided into normal group， model group and MQJWJD high-dose and low-dose groups， with eight rats in each group. Medication groups were given relevant medicine for gavage. The level of TNF-α in bronchoalveolar lavage fluid （BALF） was measured by ELISA. The expression of NF-κB protein in lung tissues was measured by immunohistochemistry. The histopathology of the lung injury was observed by light microscope. Results Compared with normal group， the level of TNF-α and the expression of NF-κB protein in the model group were higher than those in the normal group （P<0.01）. Compared with model group， the level of TNF-α and the expression of NF-κB protein in MQJWJD low-dose and high-dose groups were lower than those in the model group （P<0.05， P<0.01）. Pathological observation showed that， compared with normal group， model group showed intratracheal， alveolar and interstitial bacteria within a large number of fine particles calm， alveolar and pulmonary interstitial visible large amounts of phagocytic fine particles of macrophages and accompanied by more neutrophilsendprint

基金项目：国家自然科学金面上项目（81673855）；国家中医药管理局重点学科项目（2009年）；上海市重点学科建设资助项目（S30301）；上海中医药大学第9批大学生科创资助项目（SHUTCM2016177）；上海中医药大学名师研究室项目（A1-Z173020711）；上海中医药大学基础医学院与曙光医院院院合作项目（2015年）；上海中医药大学德育渗透课题（A1-60102009）

通讯作者：杨爱东，E-mail：aidongy@126.com

and lymphocyte infiltration； Lung tissue pathological changes were significantly lighter in MQJWJD high-dose and low-dose groups than the model group. MQJWJD high-dose group showed mild inflammation， alveolar and pulmonary interstitial visible phagocytic fine particles of macrophages， a small amount of neutrophils and lymphocyte infiltration. Conclusion MQJWJD can reduce the pulmonary injury in rats induced by particulate matter and has protective effects on the rat model through decreasing the levels of TNF-α and the expressions of NF-κB protein in injured lung tissues.

Keywords： modified Qianjin Weijing Decoction； particulate matter； pulmonary injury； TNF-α； NF-κB； rats

研究表明，大氣细颗粒物暴露与肺癌具有明显的相关性，大气中细颗粒物浓度每增加10 μg/m3，肺癌死亡率可增加15%～27%[1]。有文献报道，颗粒物致肺损伤的机制之一是导致机体发生炎性损伤[2]。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）是炎症反应中重要的启动因子，核因子-κB（NF-κB）是免疫调控信号通路中重要的转录调控因子，二者在炎性反应过程中起着重要作用。前期研究表明，加味千金苇茎汤能够减轻慢性阻塞性肺疾病模型大鼠的肺组织损伤[3]。本研究进一步观察其对大气细颗粒物致肺损伤模型大鼠肺组织NF-κB蛋白表达和支气管肺泡灌洗液TNF-α含量的影响，探讨其可能的作用机制。

1 实验材料

1.1 动物

清洁级Wistar雄性大鼠32只，7～9周龄，体质量（184±11）g，上海西普尔-必凯实验动物有限公司，动物合格证号2008001664259。饲养于上海中医药大学实验动物中心清洁级饲养区，温度（21±2）℃，相对湿度45%～50%，昼夜光照节律，自由摄食饮水，适应性喂养1周。

1.2 药物

加味千金苇茎汤（芦根30 g，冬瓜子30 g，桃仁12 g，薏苡仁15 g，鱼腥草20 g，蒲公英20 g），饮片均购自北京同仁堂上海药店责任有限公司，制成含2 g原药材/mL的药液，高温高压灭菌，4 ℃冷藏备用。

1.3 主要试剂与仪器

大气细颗粒物，直径（31.9±0.6）?m，美国国家标准与技术研究院，批号P1192006。TNF-α ELISA试剂盒，美国Immunowaw公司，批号D15A631；NF-κB p65免疫组化试剂盒，美国Santa Cruz公司，批号E0205。低温冷冻离心机（美国Sigma），生物安全柜（美国Sigma），BH2显微镜（日本OLYMPUS）。

2 实验方法

2.1 分组、造模和给药

按随机数字表法将32只Wistar雄性大鼠分为正常组、模型组和加味千金苇茎汤高、低剂量组，每组8只。正常组气管滴注1 mL/kg生理盐水，其他组大鼠气管滴注1 mL/kg细颗粒物生理盐水混悬液（相当于15 mg/kg细颗粒物），隔日1次，共3次[4]。加味千金苇茎汤高、低剂量组每日分别给予10 mL/kg和5 mL/kg加味千金苇茎汤药液灌胃，正常组和模型组给予等体积蒸馏水，连续7 d。加味千金苇茎汤用药量按人与动物的体表面积换算[5]。

2.2 一般观察

实验期间观察所有大鼠精神状态、活动情况、皮毛光泽度、死亡情况等，每日记录大鼠体质量。

2.3 标本采集

最后1次灌胃结束后24 h，大鼠腹腔注射25%乌拉坦（4 mL/kg）麻醉，腹主动脉抽血处死。大鼠颈部气管纵行切口，用剥离针逐层分离组织，最终暴露气管，钝性分离出双肺组织。用眼科剪在支气管上剪一小口，用灌洗针从剪开的小口处插入气管，抽取3 mL生理盐水灌洗支气管2次，每次反复回抽3次，回收灌洗液置于离心管。每只大鼠收集支气管肺泡灌洗液6 mL，用于TNF-α含量检测，分装后于-80 ℃冰箱保存。剖去肺部周围组织，取右肺上叶，生理盐水冲洗后置于10%甲醛溶液中固定，用于光镜病理观察及肺组织NF-κB蛋白表达免疫组化检测。

2.4 肺泡灌洗液肿瘤坏死因子-α含量测定

取支气管肺泡灌洗液，3000 r/min离心10 min，取上清液，ELISA测定肺泡灌洗液TNF-α含量，严格按照试剂盒说明书操作。

2.5 肺组织核因子-κB蛋白表达测定endprint

采用IMS细胞图像分析系统医学图像分析软件，对免疫组化结果进行图像采集和定量分析。高倍镜下每张切片随机选择不相重叠的3个视野，细胞核为蓝色，NF-κB阳性细胞为棕黄色。计算每例样本蛋白染色阳性面积率（阳性细胞面积÷总面积）作为比较参数。

2.6 病理观察

取1 cm×1 cm×0.3 cm右上肺组织，常规10%甲醛固定，逐级脱水，石蠟包埋，切片，漂洗，常规HE染色，光镜下观察组织变化。

3 统计学方法

采用SPSS21.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，多组间均数比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD法。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 一般状况

实验期间未见大鼠死亡。模型组较正常组大鼠染毒后出现呼吸急促、活动减少、皮毛无光泽，加味千金苇茎汤低、高剂量组大鼠活动较模型组明显活跃。实验开始前，各组大鼠体质量无显著差异。实验结束后，模型组较正常组大鼠体质量显著减轻（P<0.01）；与模型组比较，加味千金苇茎汤低、高剂量组大鼠体质量显著增加，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。结果见表1。

4.2 肺大体形态

肉眼观察可见正常组双肺呈淡粉红色，质软，弹性好，未见异常；模型组双肺呈暗红色，明显充血，表面可见片状灰黑色瘀斑，弹性差，呈实变感；加味千金苇茎汤低剂量组双肺表面呈红色，轻微充血，可见散在灰白色小斑点，弹性略差；加味千金苇茎汤高剂量组双肺表面呈淡红色，可见少量散在灰白色小斑点，质地较软，弹性较好，未见充血、水肿等。结果见图1。

4.3 加味千金苇茎汤对模型大鼠支气管肺泡灌洗液肿瘤坏死因子-α含量的影响

与正常组比较，模型组大鼠肺泡灌洗液TNF-α含量显著升高（P<0.01）；与模型组比较，加味千金苇茎汤低、高剂量组大鼠肺泡灌洗液TNF-α含量显著降低（P<0.05，P<0.01）。结果见表2。

4.4 加味千金苇茎汤对模型大鼠肺组织核因子-κB蛋白表达的影响

与正常组比较，模型组大鼠肺组织NF-κB蛋白表达阳性面积率显著升高（P<0.01）；与模型组比较，加味千金苇茎汤低、高剂量组大鼠肺组织NF-κB蛋白表达阳性面积率显著降低（P<0.05，P<0.01）。结果见表3、图2。

4.5 肺组织病理变化

正常组肺组织示正常小气道上皮、肺泡上皮及肺泡壁毛细血管，未见细颗粒物沉着及炎症细胞；模型组肺组织小气管内、肺泡及肺间质内有大量细颗粒物沉着，小气道内可见脱落的上皮及大量炎症细胞浸润，肺泡及肺间质内可见大量吞噬细颗粒物的巨噬细胞并伴有较多中性粒细胞和淋巴细胞浸润；加味千金苇茎汤低剂量组肺组织小气道内、肺泡及肺间质内可见吞噬细颗粒物的巨噬细胞，肺间质内可见中性粒细胞和淋巴细胞浸润；加味千金苇茎汤高剂量组肺组织炎症反应较轻，肺泡及肺间质内可见吞噬细颗粒物的巨噬细胞，肺间质内可见少量中性粒细胞和淋巴细胞浸润。结果见图3。

5 讨论

流行病学研究表明，大气细颗粒物浓度升高与哮喘、肺炎、肺癌等呼吸系统疾病的发病率、死亡率呈正相关[6-8]。大气细颗粒物属于浊邪，其致肺损伤属中医学“咳喘”“肺萎”“肺胀”等范畴。针对细颗粒物致肺损伤“热（毒）、痰、瘀”之病机，我们认为治宜用清肺化痰活血法，方选加味千金苇茎汤。千金苇茎汤系唐代医家孙思邈所创，原方由芦根、冬瓜子、桃仁、薏苡仁组成，具清肺化痰、逐瘀排脓之效。研究表明，千金苇茎汤被广泛应用于治疗大叶性肺炎、慢性支气管炎急性发作、慢性阻塞性肺疾病、小儿过敏性咳嗽、小儿急性化脓性扁桃体炎等多种热毒蕴滞、痰瘀互结之证[9]。另有研究发现，鱼腥草和蒲公英能减轻急性肺损伤（ALT）动物模型肺组织的炎症反应，对ALT动物模型具有一定的保护作用[10-11]。

研究表明，大气细颗粒物导致的肺病理变化主要表现为炎性改变[12]。TNF-α主要由被激活的巨噬细胞产生，是ALT早期产生的促炎症因子之一[13]。NF-κB是最重要的转录因子之一，广泛存在于各种细胞胞浆内，在炎症、免疫应答、细胞黏附以及抗细胞凋亡中起重要作用[14]，二者作为炎症反应发生早期的前炎症因子能够刺激肺上皮细胞、内皮细胞及成纤维母细胞等细胞因子和黏附分子，进而诱导中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和多形核白细胞等的聚集，最终导致炎症的发生[2]。姜瑞雪等[15]研究表明，随着PM2.5浓度的增加，大鼠肺组织TNF-α的表达水平显著增高。姜智海等[16]用大气细颗粒物染毒于Ⅱ型肺泡上皮细胞后，发现Ⅱ型肺泡上皮细胞增加释放的一系列与炎症反应和炎症细胞增殖相关的细胞因子或与NF-κB表达相关。

本实验结果表明，与正常组比较，模型组大鼠支气管肺泡灌洗液TNF-α含量和肺组织NF-κB蛋白表达水平升高，模型组肺组织小气管内、肺泡及肺间质内有大量细颗粒物沉着，小气道内可见脱落的上皮及大量炎症细胞浸润，肺泡及肺间质内可见大量吞噬细颗粒物的巨噬细胞并伴有较多中性粒细胞和淋巴细胞浸润，表明大气细颗粒物致大鼠肺损伤模型建立成功；与模型组比较，加味千金苇茎汤各剂量组肺组织病理改变减轻，支气管肺泡灌洗液TNF-α含量和肺组织NF-κB蛋白表达明显降低，提示加味千金苇茎汤能够减轻大气细颗粒物致大鼠肺损伤模型大鼠的肺组织损伤，对该模型肺组织具有保护作用，其机制可能与其降低TNF-α含量、下调NF-κB蛋白表达有关。

参考文献：

[1] TURNER M C， KREWSKI D， POPE C A， et al. Long-term ambient fine particulate matter air pollution and lung cancer in a large cohort of never-smokers[J]. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine，2011，184（12）：1374-1381.endprint

[2] 毕谆，周红刚.PM2.5引起的肺部疾病及其作用机制的研究进展[J].环境工程，2016，34（S1）：496-499.

[3] 张海英，杨爱东，闫玲玲，等.加味千金苇茎汤对慢性阻塞性肺疾病大鼠肺组织SIGIRR蛋白及其mRNA表达的影响[J].辽宁中医药大学学报， 2015，17（2）：19-22.

[4] 杨莹莹，李莉珊，吕鹏，等.清肺化痰中药对大气PM2.5致大鼠肺损伤的干预作用研究[J].环境与健康杂志，2015，32（5）：377-380.

[5] 陈奇.中药药理研究方法学[M].北京：人民卫生出版社，1996：1103.

[6] JIN C， SHELBURNE C P， LI G， et al. Particulate allergens potentiate allergic asthma in mice through sustained IgE mediated mast cell activation[J]. J Clin Invest，2011，121（3）：941-955.

[7] KATANODA K， SOBUE T， SATOH H， et al. An association between long-term exposure to ambient air pollution and mortality from lung cancer and respiratory diseases in Japan[J]. Journal of Epidemiology，2011，21（2）：132-143.

[8] HYSTAD P， DEMERS P A， JOHNSON K C， et al. Long-term residential exposure to air pollution and lung cancer risk[J]. Epidemiology， 2013，24（5）：762-772.

[9] 石海.對千金苇茎汤的再认识[J].世界中西医结合杂志，2010，5（2）：101-102.

[10] 李风雷，刘晓晴，柳青，等.鱼腥草对油酸性急性肺损伤大鼠肺组织TNF-α表达的影响[J].中国病理生理杂志，2003，19（4）：547-548.

[11] 平家奇，高海飞，高海飞，等.蒲公英对急性肺损伤小鼠的保护作用[J].中国兽医杂志，2010，46（7）：37-38.

[12] 闫庆倩，赵学彬，杨莉，等.不同地区大气PM2.5致大鼠肺损伤的比较实验研究[J].环境与健康杂志，2012，29（1）：7-11.

[13] 熊琪，茹琴，陈琳，等.PM2.5对肺泡巨噬细胞功能影响的研究进展[J].环境与健康杂志，2013，30（12）：1128-1130.

[14] IMANIFOOLADI A A， YAZDANI S， NOURANI M R. The role of nuclear factor-kappaB in inflammatory lung disease[J]. Inflammation & Allergy-Drug Targets，2010，9（3）：197-205.

[15] 姜瑞雪，万运方，刘雁云，等.PM2.5对Wistar大鼠肺组织中HMGB1、TNF-α、IL-6表达的影响[J].环境卫生学杂志，2014，4（6）：514-517.

[16] 姜智海，宋伟民.核转录因子-kappa B在PM2.5染毒小鼠急性肺损伤中的作用[J].环境与职业医学，2005，22（6）：483-486.

（收稿日期：2017-04-30）

（修回日期：2017-05-14；编辑：华强）endprint