AGT基因多态性与出血性脑卒中的相关性研究

刘文鹏，刘艳，魏灿，于建刚，陈爱民，丁云龙，管清华，赵旭平

脑卒中分为出血性脑卒中和缺血性脑卒中，出血性脑卒中是指非外伤性脑实质内血管破裂而引起的出血，又称为颅内出血(ICH)，出血性脑卒中预后极差，其死亡率和病残率高，危害严重。由于一直缺乏有效的治疗脑卒中的手段，目前认为预防是最好的措施，所以明确哪些因素可能导致出血性脑卒中发病，并进行积极干预就显得极为重要。肾素-血管紧张素系统在高血压和心脑血管疾病的发生过程中扮演着重要的角色，编码血管紧张素原的AGT基因与脑卒中的相关性受到越来越多的关注。本研究对出血性脑卒中患者和对照人群中AGT基因上的单核苷酸多态性(SNP)rs2067853和rs4762进行了检测，并分析了两个SNP位点与出血性脑卒中易感的相关性。

1 对象与方法

1.1 对象 选取2012年6月～2015年3月江苏省靖江市人民医院神经内科入院的ICH患者255例(ICH组)，其中男157例，女98例，平均年龄(64.24±9.32)岁。ICH组的纳入标准：诊断均符合全国第四届脑血管病学术会议通过的诊断标准，并经头颅CT或MRI检查证实。排除缺血性脑卒中患者，排除外伤、药物、肿瘤、脑血管畸形或动脉瘤等因素引起的出血性脑卒中患者。另外选择本院健康体检者321名作为正常对照组(NC组)，其中男195名，女126名，平均年龄(63.37±3.89)岁。排除标准：脑卒中、肝、肺、肾等器官功能性疾病、血液病、肿瘤、癫痫、自身免疫性疾病、甲状腺疾病等和有脑血管病史的人。全部研究对象间无血缘关系，均为汉族，来自江苏地区。所有研究对象均同意参加本研究并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 临床资料及标本采集 收集和检测所有对象的如下信息：性别、年龄、体质量指数(BMI)、吸烟、饮酒、是否患高血压、糖尿病、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、三酰甘油(TG)、空腹血糖、糖化血红蛋白等生理生化指标。血液生化指标测试时，受试者禁食12～14 h后，抽取肘静脉血约10 ml，加入到乙二胺四乙酸二钾抗凝试管中，轻轻混匀，置于-20℃冰箱中储存待用。用全自动生化分析仪测定TC、TG、血糖等血液常规生化指标。

1.2.2 基因组DNA提取 采集乙二胺四乙酸二钾抗凝静脉血5 ml，-20 ℃冰箱保存备用。用美国Axygen-AxyPrep血基因组DNA小量制备试剂盒(Axygen，美国)提取白细胞基因组DNA，提取过程严格按照试剂盒说明书进行，-80 ℃保存备用。

1.2.3 引物设计和合成 AGT基因的引物设计采用Sequenom公司提供的在线多重引物设计程序以及MassARRAYAssay Designer 3.1引物设计软件包(Sequenom，美国)设计PCR扩增引物、单碱基延伸引物，每个SNP位点对应两条PCR扩增引物和一条延伸引物。每条PCR引物5′端增加10个碱基的tag：ACG TTG GAT G。用于rs4762 分型PCR上游引物：5′-ACG TTG GAT GAC AAA CGG CTG CTT CAG GTG-3′，PCR下游引物：5′-ACG TTG GAT GAG GGC AGG GCT GAT AGC CA-3′，延伸引物：5′-ccc ttA ACA CGC CCA CCA CC-3′；用于rs2067853分型 PCR上游引物：5′-ACG TTG GAT GGC ACT TTC GTT TGC ACA GTC-3′，PCR下游引物：5′-ACG TTG GAT GAC GTC TTG CCA CAA TAA GCC-3′，延伸引物：5′-tgt cTA CAT CTG TTT GGC TGC TAA AT-3′。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.4 SNP分型检测 应用Sequenom公司的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱系统平台(MALDI-TOF MS)进行rs4762和rs2067853的分型检测，由上海邃志生物科技有限公司完成。所有需要分型的DNA样本都进行标准化处理，稀释到10 ng/μl。样本依次进行如下操作：(1) 进行PCR扩增：DNA样本1 μl、水0.95 μl、0.625 μl PCR缓冲液(含15 mmol/L MgCl2)、1 μl的dNTP(2.5 mmol/L)、0.325 μl的MgCl2(25 mmol/L)、1 μl引物混合液(每个位点的上游引物和下游引物浓度分别为1 μmol/L)以及0.5 U 的HotStar Taq酶 (Qiagen)均匀混合。PCR反应条件：94 ℃预变性15 min；94 ℃变性20 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共45个循环； 72 ℃延伸3 min，最后4℃保存。(2)SAP酶消化反应消除多余dNTP：PCR扩增后，用虾碱性磷酸酶(SAP)消化剩余的dNTP，反应体系包括1.53 μl水、0.17 μl SAP缓冲液和0.3 U SAP酶(Sequenom)，37 ℃40 min 反应，然后85 ℃ 5 min使SAP酶失活，4 ℃保存。(3)单碱基延伸反应：采用Sequenom专用iPLEX试剂盒进行SNP基因型分型检测。SAP酶处理后，在0.755 μl水、0.2 μl 10× iPLEX缓冲液、0.2 μl终止混合物、0.041 μl iPLEX酶(Sequenom)混合液中加入0.804 μl(每个位点的延伸引物浓度分别为10 μmol/L)的延伸引物。单碱基延伸反应在下列条件下进行：首先第一步94 ℃预变性30 s；其次第二步94 ℃变性5 s，52 ℃退火5 s，80 ℃延伸5 s(其中52 ℃退火5 s，80 ℃延伸5 s先进行5个小循环)，第二步变性-退火-延伸共进行40个大循环；最后72 ℃延伸3 min，4 ℃保存。(4)交换树脂进行纯化：在终止反应物中加入6 mg阳离子交换树脂(Sequenom)脱盐，混合后加入25 μl水悬浮，离心待用。使用MassARRAY Nanodispenser (Sequenom)将最终的分型产物点样到一块384孔的spectroCHIP(Sequenom)上，并用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行分型分析。最终结果由MassARRAYRT软件系统(版本号3.0.0.4)进行实时读取，并由MassARRAY Typer软件系统(版本号4.0)完成基因分型分析。根据分子量的不同，rs4762、rs2067853位点的基因型分别读取为CC、CT、TT三种基因型。

2 结 果

2.1 ICH组与对照组一般临床资料的比较 见表1。ICH组和NC组两组在年龄、性别、TC、TG、LDL-C比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。两组在BMI、HDL-C、空腹血糖、糖化血红蛋白、吸烟、饮酒、高血压、糖尿病方面比较，差异有统计学意义(P<0.05～0.001)。

2.2 基因分型结果和Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验 在所有的576个样本中都成功的进行了SNP分型检测，rs2067853和rs4762位点均检测到三种基因型：CC、CT、TT。经Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验，rs2067853和rs4762位点的等位基因和基因型在研究人群中的分布频率均符合遗传平衡，具有群体代表性(P>0.05)。

2.3 两组基因型和等位基因分布频率的比较 见表2，表3。rs2067853基因型频率在ICH组和对照组间差异有统计学意义(P=0.012)；按照性别进一步分层分析后发现，男性中rs2067853基因型分布频率在两组间差异有统计学意义(P=0.045)；而在女性中，两组间频率差异无统计学意义(P>0.05)。rs4762位点基因型和等位基因分布频率在ICH组与对照组间差异无统计学意义，按照性别进一步分层分析后，两组间差异仍无统计学意义(均P>0.05)。

表1 ICH组与对照组一般临床资料比较(x±s，例，%，)临床资料ICH组(n=255)对照组(n=321)年龄(岁)64．24±9．3263．37±3．89男/女157/98195/126BMI(kg/m2)26．32±2．3323．89±1．53∗∗TC(mmol/L)4．74±0．934．72±0．84TG(mmol/L)1．65±1．701．51±0．93HDL⁃C(mmol/L)1．33±0．321．27±0．26∗LDL⁃C(mmol/L)2．74±0．772．76±0．69空腹血糖(mmol/L)6．24±2．205．37±1．26∗∗糖化血红蛋白(%)5．88±1．045．26±0．89∗∗吸烟65(25．5)42(13．1)∗∗饮酒49(19．2)17(5．3)∗∗高血压232(91．0)36(11．2)∗∗糖尿病32(12．5)10(3．1)∗∗ 注：与对照组比较∗P<005，∗∗P<0001

表2 两组rs2067853基因型和等位基因型分布频率的比较(例，%)分组例数基因型TTCTCC等位基因TC全部 ICH组25511(4．3)71(27．8)173(67．8)∗93(18．2)417(81．8) NC组3212(0．6)89(27．7)230(71．7)93(14．5)549(85．5)女 ICH组984(4．1)28(28．6)66(67．3)36(18．4)160(81．6) NC组1261(0．8)30(23．8)95(75．4)32(12．7)220(87．3)男 ICH组1577(4．5)43(27．4)107(68．2)△57(18．2)257(81．8) NC组1951(0．5)59(30．3)135(69．2)61(15．6)329(84．4) 注：与对照组比较∗P<005；与男性对照组比较，△P<005

表3 两组rs4762基因型和等位基因型分布频率的比较(例，%)分组例数基因型TTCTCC等位基因TC全部 ICH组2551(0．4)32(12．5)222(87．1)34(6．7)474(93．3) NC组3213(0．9)45(14)273(85)51(7．9)591(92．1)女 ICH组980(0．0)18(18．4)80(81．6)18(9．2)178(90．8) NC组1261(0．8)17(13．5)108(85．7)19(7．5)233(92．5)男 ICH组1571(0．6)14(8．9)142(90．4)16(5．1)298(94．9) NC组1952(1．0)28(14．4)165(84．6)32(8．2)358(91．8)

2.4 在显性和隐性两种遗传模型下男性中两组rs2067853基因型分布频率的比较 见表4。在显性遗传模型下，两组间男性rs2067853基因型分布频率差异无统计学意义(P>0.05)；在隐性遗传模型下，两组间基因型分布频率差异有统计学意义(P=0.014，OR=9.053，95%CI：1.102～74.386)，TT基因型是男性中出血性脑卒中的风险因素。

表4 两组男性rs2067853基因型分布频率的比较(例，%)分组显性模型基因型TT+CTCC隐性模型基因型TTCC+CTICH组50(31．8)107(68．2)7(4．5)150(95．5)△NC组60(30．8)135(69．2)1(0．5)194(99．5) 注：与男性对照组比较△P<005

2.5 脑卒中相关风险因素的Logistic回归分析 以是否发生出血性脑卒中为因变量，以性别和基因型的联合作用以及高血压、糖尿病、高密度脂蛋白等有显著差异的生理生化指标为自变量进行Logistic回归分析。回归分析结果显示，携带rs2067853 TT基因型的男性(OR=16.124，95%CI：1.510～172.164)、高血压(OR=63.385，95%CI：32.778～122.573)、血糖(OR=1.306，95%CI：1.017～1.676)、糖化血红蛋白(OR=1.621，95%CI：1.042～2.521)、BMI(OR=1.742，95%CI：1.478～2.054)是出血性脑卒中的风险因素。

3 讨 论

研究[1]发现，高血压是出血性脑卒中发生的主要危险因素，因此降压治疗对预防卒中发病和复发尤为重要。肾素-血管紧张素系统在血压调节及高血压的形成上具有十分重要的作用。高血压是脑卒中的危险因素，遗传因素在出血性脑卒中的发生过程中起了非常重要的作用。血管紧张素原是一种主要在肝脏合成的大分子球蛋白，是肾素作用的唯一底物。血管紧张素原是血管紧张素肽的前体，是肾素-血管紧张素系统 (RAS) 的一种限速底物[2]。血管紧张素原经过两步反应转化为活性物质血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)，AngⅡ作用于靶器官(如肾、肾上腺、血管等)受体而发挥生理效应。在正常情况下，RAS对心血管系统的正常发育、心血管功能稳态、电解质和体液平衡的维持、以及血压的调节均有重要作用。而高浓度的AGT长期刺激RAS系统可导致增加心血管疾病的患病倾向[3]。人类AGT基因定位于lq42-43区段，编码AGT，AGT基因的SNP与高血压的发生相关。我国学者李立新等[4]研究发现，高血压是出血性脑卒中发生的主要危险因素，因此本研究对AGT基因上SNP与出血性脑卒中易感的相关性进行了探讨。

rs2067853是AGT基因上3′端的C→T突变，不改变氨基酸，位于调控区。rs4762位点是第2外显子上620位核苷酸C→T突变，导致第207位氨基酸由苏氨酸变成蛋氨酸，即Thr207Met，又称Thr174Met。2013年Al-Najai等[5]对沙特阿拉伯大规模人群的研究发现，rs2067853位点与高血压和以及心肌梗死的发生相关，GG基因型的人患高血压和心肌梗死的风险高于其他基因型。rs4762与高血压的相关性在不同的研究群体中得出不同的结论。2013年朱旭明等[6]对8个研究群体的Meta分析发现，黄种人AGT基因T174M多态性的C等位基因及CC基因型能降低患高血压的风险。而2014年，Li等[7]对中国北方人群的研究发现，rs4762与中国人群高血压的发生无关。除了对rs4762与高血压的易感进行了相关研究外，一些研究者还对Thr207Met(又称Thr174Met)是否与脑卒中易感相关进行了研究。Park等[8]对韩国脑卒中患者的研究发现，rs4762位点只与出血性脑卒中的发生相关，与缺血性脑卒中的发生无关。Stetskaia等[9]对俄国脑卒中患者的研究发现，携带rs4762M等位基因的个体，患脑卒中的风险是其他基因型的1.86倍，但是这种相关性只出现在女性群体中。我国学者也对rs4762与脑卒中的易感性进行了相关的研究。岳月红等[10]对高血压和脑梗死组进行研究发现,174 MT+MM基因型是高血压的保护因素；但是与脑梗死的发生无关。而李宏芬等[11]研究发现，AGT基因174TM基因型和M等位基因可能为脑梗死的易患因素。上述这些研究对于Thr207Met(又称Thr174Met)的结论在不同人种、不同研究群体、不同疾病、不同性别和不同脑卒中类型中的结论存在差异，甚至得出相反的结论。本研究探讨了这些SNP位点与中国汉族人群出血性脑卒中易感是否存在相关性发现，无论是男性还是女性中rs4762(Thr207Met)与出血性脑卒中的发生无关。与Park等[8]在韩国人群中的研究结果不同，这种差异可能是由于人种不同导致的。而AGT基因上的另外一个位点rs2067853则与出血性脑卒中的发生相关，但是这种相关性只出现在男性患者中。推测性别在RAS系统影响脑卒中的发生过程中可能存在一定的调节作用。本研究还发现，男性中rs2067853位点是以隐性遗传模型的方式影响出血性脑卒中的发生风险，TT基因型的发生风险是其他基因型的9.053倍(调整后OR=16.124)，说明该位点对脑卒中易感风险的影响要达到一定的基因剂量效应。本研究指出AGT基因上的rs2067853位点与中国汉族人群出血性脑卒中的易感相关，该研究结果为评估脑卒中的发生风险提供了一定的研究基础。但AGT基因上的SNP多态性位点很多，并且目前研究群体数量相对较少，需要进行更多SNP位点、更大规模样本人群的研究来明确AGT基因与出血性脑卒中易感的相关性。同时更要综合考虑其他基因、生理生化指标以及环境因素等多方面因素对出血性脑卒中发生风险的影响。

本研究揭示了AGT基因与出血性脑卒中发生的相关性，结果表明AGT基因的不同位点突变对AGT基因的功能产生不同的影响。AGT基因在RAS系统中起着非常重要的作用，可能通过某种性别相关的机制影响了出血性脑卒中的发生。AGT基因或者基因上的SNP位点通过哪些作用机制与哪些因素共同作用影响了脑卒中的发生，目前还不十分明确，后续还需要进行更多的功能学方面的研究来进一步探索和挖掘相关的机制。

[1] Franks PW. Identifying genes for primary hypertension: methodological limitations and gene-environment interactions[J]. J Hum Hypertens, 2009, 23: 227.

[2] Carey RM. The intrarenal renin-angiotensin system in hypertension[J]. Adv Chronic Kidney Dis, 2015, 22: 204.

[3] Halushka MK, Fan JB, Bentley K, et al. Patterns of single-nucleotide polymorphisms in candidate genes for blood-pressure homeostasis[J]. Nat Genet, 1999, 22: 239.

[4] 李立新，李琳琳．缺血性和出血性脑卒中危险因素分析[J]．郑州大学学报:医学版，2010，45：313.

[5] Al-Najai M, Muiya P, Tahir AI, et al. Association of the angiotensinogen gene polymorphism with atherosclerosis and its risk traits in the Saudi population[J]. BMC Cardiovasc Disord, 2013, 13: 17.

[6] 朱旭明，谢国强，张健，等．血管紧张素原基因M235T多态性与原发性高血压相关性的Meta分析[J]．重庆医学，2013,42：3759.

[7] Li H, Du Z, Zhang L, et al. The relationship between angiotensinogen gene polymorphisms and essential hypertension in a Northern Han Chinese population[J]. Angiology, 2014, 65: 614.

[8] Park HK, Kim MC, Kim SM, et al. Assessment of two missense polymorphisms (rs4762 and rs699) of the angiotensinogen gene and stroke[J]. Exp Ther Med, 2013, 5: 343.

[9] Stetskaia TA, Bushueva OIu, Bulgakova IV, et al. Association of T174M polymorphism of the angiotensinogen gene with the higher risk of cerebral stroke in women[J]. Ter Arkh, 2014, 86: 66.

[10] 岳月红，李震中，王惠凌，等．血管紧张素原基因M235T和T174M多态性与脑梗死的相关性研究[J]．脑与神经疾病杂志，2008，16：164．

[11] 李宏芬，王颖杰，沈志霞．血管紧张素原基因T174M多态性与脑梗死及高血压的关系[J]．中国现代医学杂志，2013，23：37．