人工关节感染微生物分子诊断的研究进展

黄子达 张翀景 李文波 方心俞 胡德庆 王启金 杨滨 林建华张文明

（福建医科大学附属第一医院骨科，福州350005）

人工关节感染又称假体周围感染（periprosthetic joint infection,PJI），是关节置换术后严重的并发症之一。初次关节置换的PJI发生率为1%～3%[1]，人工关节翻修术的PJI发生率可达3%～10%[2]。PJI常需多次手术和长时间的抗生素治疗，明显增加治疗费用和并发症、延长住院时间、影响治疗效果，严重者甚至需要截肢，给患者、家庭和社会带来沉重负担。

及时和准确的病原微生物诊断能指导临床医师选择合理的抗生素和合适的手术方法，是PJI治疗成功的关键。关节液或假体周围组织微生物培养是目前PJI微生物诊断的主要方法，但由于假体表面微生物生物膜存在、培养前使用抗生素、部分微生物生长缓慢、培养条件苛刻等原因，PJI微生物培养阳性率仅为40%～70%[3]，且部分细菌（如痤疮丙酸杆菌）培养时间需2周以上。如何提高PJI的微生物检出阳性率和效率是亟待解决的问题。

微生物分子诊断方法主要指通过检测临床样本中的微生物核酸来判断样本中微生物的有无，鉴定微生物种属和分型，甚至获取微生物致病或耐药基因信息。微生物分子诊断方法具有无需培养、检测灵敏度高、检测时间短、鉴定准确性高等特点，已被广泛应用于脓毒血症、脑膜炎、肺炎等感染性疾病的病原诊断，可有效弥补培养方法的不足，提高了感染性疾病的微生物检出率，缩短检测时间。近年来，微生物分子诊断方法也被用于PJI的诊断，本文拟从不同的分子诊断技术体系，包括聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）及其衍生技术、核酸杂交技术、基因芯片技术以及二代测序技术等方面，综述其在PJI病原微生物检测和诊断中的应用。

1 PCR及其衍生技术

PCR技术是最早、最广泛应用的PJI病原微生物诊断方法，该技术可以通过特异或非特异引物，简便、快速地将研究的基因或片段扩增百万倍，扩增产物经各种方法检测获得待测核酸序列的信息。根据PCR引物的特异性，可分为宽泛围PCR与特异PCR。根据检测的核酸类型不同，可分为检测DNA的普通PCR与检测RNA的逆转录PCR。同时，结合其他检测方法又衍生出多种不同技术，包括多重PCR技术、PCR结合微流控芯片或电离质谱分析技术等。

1.1 宽泛围PCR（broad-range PCR，BR-PCR）

BR-PCR为针对细菌中编码16S rRNA或真菌中编码转录间隔区的DNA基因上高度保守区域设计通用引物，扩增出间隔其中的可变区域，经Sanger一代测序得到核酸序列，再与参考数据库比对，获取微生物种属信息[4]。BR-PCR是最早被应用于检测PJI病原微生物的分子诊断方法。

但不同的检测标本、引物、试剂都可能影响BRPCR检测结果。Gomez等[5]使用BR-PCR检测翻修取出假体的超声裂解液，发现BR-PCR对PJI诊断的敏感性为70.4%，特异性为97.8%。一项在法国开展的多中心研究纳入了215例PJI病例，BR-PCR仅可在70%（151/251）PJI病例的假体周围组织中检出细菌，对PJI诊断敏感性为73.3%[6]。Huang等[7]使用BRPCR方法分别检测关节液、假体周围组织及超声裂解液，发现BR-PCR仅在34%的假体周围组织中检出细菌，远低于其他两种标本。

BR-PCR检测微生物DNA时无法区分微生物存活与否，且BR-PCR对PJI诊断效率的变异性大、步骤繁琐、耗时相对长，因此目前不推荐其作为PJI病原微生物诊断的常规检验项目，可用于培养阴性病例的补充检查。但鉴于其高假阳性率，应审慎解读BRPCR的检测结果。

1.2 逆转录 BR-PCR（reverse transcription broadrange PCR，RT-BR-PCR）

RT-BR-PCR是利用逆转录PCR技术直接检测16S rRNA。由于细菌细胞内RNA数量远多于DNA，且RNA仅存在于活细菌中，因此理论上相对于直接检测DNA的PCR，RT-BR-PCR灵敏度更高，并可鉴别微生物存活状态。但在实际操作中，因为样本RNA易被降解、样本保存条件要求高，利用RT-BRPCR进行PJI的病原微生物检测研究并不多。Lee等[8]使用RT-BR-PCR检测了11例临床样本，除了得到与8例培养阳性一致的结果外，在2例培养阴性的标本中也检测到细菌，PCR和培养均阴性的1例最终被临床证实为非感染病例。Fang等[9]则发现RTPCR对微生物的检测灵敏度高于培养方法，对PJI诊断敏感性为73.6%，特异性为100%，准确性为85.9%，与检测DNA的PCR相比，RT-BR-PCR的假阳性率更低。

1.3 特异性PCR（specific PCR，S-PCR）

S-PCR是指PCR的引物仅针对某一特定种属微生物（如金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌）的管家基因序列。只要目标序列和引物设计得当，S-PCR可以用于检测任意的微生物[4]。与BR-PCR相比，SPCR的检测灵敏度和特异度均更高，且数小时内使用“终点法”即可得到检测结果（有或无）[4]。但S-PCR体系的引物单一，无法用于临床样本中病原微生物的筛检，因此在PJI诊断的应用较少。S-PCR具备高度种属特异性，因此常被用于验证其他分子诊断方法的检测结果。

1.4 多重PCR（multiplex PCR，M-PCR）

M-PCR又称为多重引物PCR或复合PCR，是在同一PCR反应体系里加上多对引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应。M-PCR可在一个反应内同时检测多种常见病原微生物的种属以及耐药基因，相当于“并联”的多个S-PCR反应，在PJI病原微生物诊断的应用逐渐增多。

商品化的M-PCR实现了自动化的样本处理和检测，增加了检查的便利性、缩短了人工操作时间、减少了污染，已成为PJI分子诊断研究的热点[10]。但有多项研究报道的结果显示，自动化的操作流程并未能提高M-PCR对PJI诊断的敏感性[11-13]。Hischebeth等[14]检测了62份关节液及超声裂解液，虽然M-PCR的阳性结果与培养基本一致，但M-PCR的敏感性仅为66.7%，远低于超声裂解液培养的88.9%。一项法国的多中心研究纳入了484份术中标本，分别使用M-PCR与BRPCR或培养方法对比，仅有47.4%培养为一种微生物的标本M-PCR检测阳性，48%的培养为多种微生物的标本M-PCR检测阳性，而且M-PCR与BR-PCR和培养的一致性并不高（53.6%～74.6%），M-PCR检测阴性与标本中的细菌浓度低密切相关，M-PCR的优势可能仅体现于取样前使用过抗生素的病例[6]。商品化的MPCR体系可作为培养方法的补充检测手段，但能否单独用于诊断PJI仍需进一步的研究证实。

1.5 PCR联合电离质谱分析（PCR/ESI-MS）

BR-PCR技术需后期测序与比对才能鉴定微生物种属，而S-PCR或M-PCR只能检测有限种类（受反应体系限制，常少于20种）的微生物。PCR/ESIMS则可通过BR-PCR和有限数量的S-PCR扩增，通过质谱分离与比对的方法实现直接检测扩增产物，鉴定微生物种属和检测耐药基因[15]。Ibis T5000质谱仪与升级后的PLEX-ID质谱仪是现有PJI相关研究中应用最多的PCR/ESI-MS仪器。

Jacovides等[15]分别使用Ibis T5000质谱仪与传统细菌培养方法检测了23例PJI患者的关节液标本，22例Ibis T5000检测阳性，18例细菌培养阳性，其中17例两种方法检出了相同的细菌，Ibis T5000与培养方法的检测一致性高。Greenwood-Quaintance等[16]分别使用PLEX-ID质谱仪与传统培养方法检测431份超声波裂解液，152例术前诊断为PJI的病例中118例经PLEX-ID检测到细菌DNA（诊断敏感性为77.6%，特异性为93.5%）；而传统培养仅106例阳性（诊断敏感性为69.7%，特异性为99.3%），两者的敏感性与特异性均有统计学差别。但PCR/ESI-MS在38%～88%的非感染性翻修病例样本中可检出细菌DNA[15,17]，提示其有较高的假阳性率，需谨慎解读阳性结果；且质谱仪器十分昂贵，单次检测成本高，限制了该技术在PJI微生物诊断中的广泛应用。

1.6 微流控芯片

受益于纳米和精细激光蚀刻技术的进步，微流控芯片可将整个生化反应体系整合于单块芯片中，自动化完成除核酸抽提以外的PCR反应全过程，极大减少了分子诊断流程中的人为错误和污染。台湾长庚医院的Chang等[18]与台湾清华大学合作，研制了专门用于检测PJI关节液中的细菌核酸的微流控芯片体系。与PCR技术相比，微流控芯片的灵敏度更高，且检测结果与临床培养及PCR结果一致性高。微流控芯片技术可实现手术室内的即时微生物诊断，拥有潜在的临床应用前景。

2 核酸杂交技术

核酸杂交技术是将已知序列的核酸单链进行信号标记制成核酸探针，之后与样品中目标病原微生物的特征互补链按碱基配对原则进行杂交，最终根据杂交信号判断样品中有无目标病原微生物，最常用的方法是荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization,FISH）。FISH无需特殊仪器，操作相对简便，成本低。但FISH的灵敏度不高，探针种类有限（常少于4种），在PJI病原微生物诊断中应用受限，也尚未见具体诊断效率的报道。使用激光共聚焦显微镜观察FISH结果，可直接观察PJI生物膜内微生物的三维分布情况，为研究生物膜的特性提供帮助[19]。

3 基因芯片技术

基因芯片技术是在核酸杂交技术基础上发展起来的高通量检测方法。在固相基片表面固定了数种序列已知的靶核苷酸探针，靶核酸与探针互补杂交时，在基片上位点即出现荧光，实现对相应病原微生物的诊断。商品化的基因芯片系统（Prove-it TM Bone and Joint）针对骨关节感染常见的60种细菌及耐药相关基因（mecA、vanA、vanB）定制了探针库，在BR-PCR的基础上行芯片杂交反应[20]。Metso等[21]用该系统检测了61例关节翻修和20例对照病例，在38例临床诊断的PJI病例中，基因芯片技术在31例中检出细菌，而培养方法仅检出28例，对照组中无假阳性病例，微生物培养结果与基因芯片技术的检测完全一致。基因芯片技术提高了核酸杂交的反应效率和对病原微生物鉴定的准确性。但由于基因芯片样品制作和标记方法复杂，检测的可重复性不高，在PJI的病原微生物诊断中并未能得到广泛应用。

4 二代测序技术（next-generation sequencing，NGS）

NGS又称为新一代测序技术，指通过单次流程内实现对数百万条以上的序列大规模平行测序，短时间内获得大量基因序列数据。相对于一代测序方法，NGS具有高通量、高准确性、低成本等突出优势，给生命科学领域的研究模式带来了全新的变化。NGS不仅在肿瘤、出生缺陷等方向的研究发展迅速[22,23]，在临床微生物诊断领域的应用也受到重视[24-26]，相对于其他分子诊断方法，NGS最大的优势是短时间内即可获取样本中几乎所有的微生物核酸信息，为临床微生物诊断提供无可比拟的便利性。目前常用的微生物NGS诊断技术包括扩增子NGS和宏基因组NGS。

4.1 扩增子NNGGSS（ampliconn NNGGSS，aaNNGGSS）

aNGS是指在BR-PCR的基础上，对PCR扩增产物行高通量测序。aNGS克服了Sanger测序对多种微生物分辨能力差的缺点，可实现对样本中所有微生物的种属定性和相对丰度分析，常被用于环境或肠道微生物组学研究。Simon等[27]研究发现aNGS除了可在临床样本中检出与培养相一致的细菌，还可检出其他多种可能致病的细菌。aNGS应用于PJI微生物诊断的研究很少，Parvizi团队的Tarabichi等[28]和Shohat等[29]使用aNGS检测关节液及组织样本，结果显示17例培养阳性的PJI病例中，aNGS在15例中检出与培养一致的微生物；11例培养阴性的PJI病例中，aNGS在9例中检出微生物。但aNGS在大多数病例中均检出多种微生物，其中包含了皮肤或肠道内常见定植菌如丙酸痤疮杆菌等，目前仍无有效的手段判断这些病菌是定植或致病的微生物，仍需更多研究来进一步验证aNGS对PJI的病原诊断价值。

4.2 宏基因组NNGGSS（metagenomicss NNGGSS，mmNNGGSS）

mNGS是指无需引物扩增，直接通过对样品中所有核酸片段构建基因组文库，经NGS获得所有序列信息后，使用生信方法去除人源序列再与微生物全基因组数据库比对，可获得样品中包括细菌、真菌、病毒及寄生虫在内的所有微生物的基因信息。Wilson等[30]使用mNGS方法成功诊断1例脑钩端螺旋体感染，显示了mNGS在临床微生物诊断中的优势，标志了微生物病原诊断进入mNGS时代。近年来，mNGS在囊性纤维支气管扩张症、脓毒血症等疾病微生物诊断中的应用逐渐增多[31]。目前，mNGS技术在PJI微生物诊断中仅有少数报告。Thoendel等[32]对PJI病例中取出的假体行超声裂解，采用基于Illumina测序平台的mNGS技术检测超声裂解液中的致病微生物，成功从1例培养阴性的PJI病例中检测出罕见的唾液支原体感染。Street等[33]使用mNGS方法检测PJI病例的超声裂解液，与培养结果相比，mNGS在种的水平上的诊断敏感性达88%（95%CI:77%～94%），特异性达88%（79%～93%）；在种属的水平上，mNGS与培养的敏感性达93%（95%CI:84%～98%）。在现有不多的研究中mNGS显示出较高的PJI诊断价值。

但样本中人源DNA对mNGS测序结果的影响很大，会漏检微生物序列或造成分型错误。如何减少人源核酸比例是提高微生物mNGS检测效率的一个重点。目前微生物核酸的富集方法主要包括：①利用促溶剂选择性溶解人类细胞壁，分离去除人源DNA；②利用特定蛋白结合原核生物中非CpG岛的甲基化DNA，将原核生物核酸分离。Thoendel等[34]使用上述两种方法富集超声裂解液中的微生物核酸，发现前者富集效率更高，但同时也减少了微生物序列的绝对数量。而过少的核酸模板量可能导致文库质控失败，无法上机测序。全基因组扩增方法（whole genome amplification,WGA）利用随机引物和链置换方法，从极微量的起始模板中扩增出足量的核酸，以满足测序要求。Thoendel等[35]比较了三种不同WGA试剂盒，发现WGA方法可显著增加模板量，但会不同程度地引入污染微生物序列而影响结果解读，其中Qiagen REPLI-g WGA试剂盒引入的污染序列最少。试剂、操作等引入的污染微生物核酸信息则是造成mNGS检测结果解读困难的最主要原因。

另外，mNGS方法理论上不仅可以诊断与鉴定微生物种类，还可获取微生物功能基因的分布和变异情况等，预测致病微生物的耐药性和毒力。但目前PJI相关的研究中未有报道，可能与PJI样本中微生物量少、读数低而造成检测结果中微生物基因组覆盖度低有关，可能需要使用更有效的微生物核酸富集方法或针对目标基因的靶向NGS检测方法。

综上，随着分子生物学技术的进展，PJI微生物分子诊断方法向着快速、简便和高通量的方向迅速发展。但目前仍存在一些问题造成分子诊断检测结果解读困难，如：①分子诊断方法灵敏度过高造成核酸污染的放大；②不同实验室间试剂、仪器、算法存在差异，缺乏标准化的质控考核标准。但随着技术体系的不断改进、自动化技术的广泛应用和相关的行业共识法规出台，微生物分子诊断方法将成为PJI病原诊断的重要手段，特别是NGS技术将成为未来重要的研究和发展方向，可更有效协助培养阴性、多重感染或罕见病原感染的PJI病例微生物的检出。