腱骨愈合过程中生物因子及信号通路调控作用的研究进展

郑博元，王华军，郑小飞，陈述祥

腱骨结合部损伤及愈合问题广泛存在于全身各关节，在膝关节交叉韧带、肩关节肩袖以及跟腱止点等重要位置尤显突出。在美国，肌腱劳损约占运动损伤的30%～50%，每年约有20万例前交叉韧带（anterior cruciate ligament，ACL）出现撕裂[1]；而肩袖损伤约占肩关节疾病的50%，发病率随年龄增长而逐步升高，美国每年用于肩袖手术及康复的费用高达70亿美元。但韧带重建后长期疗效并不乐观，约有32%的ACL重建患者预后不满意，10%需要再次手术，肩袖修复术后再断裂率也高达30%～94%[2-3]。牢固的腱骨愈合是保证韧带重建成功并发挥功能的关键[4]，而腱骨损伤和愈合的不同阶段均受到多种生物因子和信号通路的调控。进一步明晰生物因子及其信号通路的调控机制和作用，同时从基因层面通过非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）调控生物因子，对改善腱骨愈合质量、加快腱骨愈合速度、降低重建术后的再断裂率具有重要意义。

1 腱骨愈合过程与生物因子

腱骨连接界面从肌腱过渡到骨通常可分为肌腱（纤维结缔组织）层、非钙化纤维软骨层、钙化纤维软骨层和骨组织层，这种组织结构有利于载荷传递以及应力的分散。修复手术很难恢复原有组织结构的生物学特性，通常只是形成了富含Ⅲ型胶原的瘢痕组织，在载荷传递以及拉应力分散等方面明显不足，也因此容易再次受到损伤[5]。术后腱骨愈合通常经历3个连续时期[6]：①第1周炎症期，炎症细胞吞噬坏死组织产生炎症反应，释放碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、转 化 生 长 因 子 -β（transforming growth factor-β，TGF-β）、血小板衍生生长因子（platelet derived growth factor，PDGF）等一系列生物因子；②第2周修复期，上述生长因子明显增多，促进细胞外基质合成以及骨细胞、软骨细胞的增殖分化；③第3周开始进入重塑期，胶原逐渐排列整齐，新形成的骨与肌腱移植物进行重塑，机械强度提高。

1.1 白细胞介素（interleukin，IL）

白细胞介素能够协调白细胞、免疫细胞和红细胞生长因子，通过传递细胞信息影响造血系统和免疫系统，在腱骨愈合过程中往往起到促炎作用。Haslauer等[7]发现在腱骨愈合的早期阶段，IL-8和IL-6分泌增加并可募集和激活中性粒细胞，进而促进急性炎症的进展。而炎性细胞因子IL-6和IL-1能够抑制肌腱衍生祖细胞（tendonderived progenitor cells，inTPC）向肌腱、软骨和骨骼分化，阻碍细胞外基质和蛋白聚糖的分泌，减缓腱骨愈合[8-9]。Lin等[10]通过敲除IL-4或IL-6的小鼠模型，验证了促炎症因子IL-6和抗炎症因子IL-4在肌腱愈合中的相反作用。由于早期炎症反应对腱骨愈合不利，因此在术后早期，应尽可能抑制IL-1、IL-6、IL-8等促炎因子的作用，同时提高IL-4等抗炎因子的正性效应。

1.2 基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）

MMPs家族因需要钙锌等离子辅助而得名，对弹力蛋白、胶原蛋白等起降解作用，参与组织的发育、创伤乃至移植的愈合重塑。MMP-1、MMP-2以及金属蛋白酶组织抑制剂-1（tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1）在小鼠和兔的腱骨界面表达，提示其参与腱骨修复的重塑过程[11-12]。Pastenak等[11]的组织学和生物力学研究结果证实，通过阻断MMPs活性可促进腱骨愈合，正常情况下MMPs对基质的分解作用不利于腱骨愈合进程。如欲恢复腱骨结合的生物及力学特性，必须抑制MMPs的产生，其中一个重要思路是增加内源性抑制剂TIMPs数量，以拮抗其对细胞外基质的降解作用。

1.3 生长因子（growth factor，GF）

1.3.1 TGF-βTGF-β是一个调节细胞生长和分化的家族，在哺乳动物细胞内有β1、β2、β3等 3个亚型。部分亚型在损伤修复过程中可促进成纤维细胞和巨噬细胞聚集以抑制慢性炎症，具有调节自身免疫和抑制移植排斥反应的作用。Kovacevic等[13]在冈上肌修复术中于腱骨表面添加TGF-β3，发现在促进早期纤维软骨生长，增加新骨形成、Ⅰ型～Ⅲ型胶原比例以及胶原纤维规整性等方面，TGF-β3添加组均优于对照组。另有研究表明，TGF-β1可诱导干细胞向韧带细胞或组织分化，具有促进术后腱-骨愈合的功能[14]。

但也有研究指出，TGF-β1并不能促进腱骨结合部位形成4层正常生理结构，只是促进了纤维瘢痕组织的增生，当TGF-β1受到抑制时，纤维化、脂肪浸润和肌肉萎缩等不利情况将显著减少[15]。有学者从纤维软骨面积、胶原组织和骨形成等方面来衡量TGF-β3的无瘢痕愈合潜能，结果表明，磷酸钙+TGF-β3组的愈合效果反而比磷酸钙组更差，提示TGF-β3对腱骨愈合过程具有干扰作用[16]。

有关TGF-β在腱骨愈合中扮演的角色，不同实验得出完全不同的结论，其原因可能是实验模型及实验过程不同，多种生长因子之间存在尚未明确、难以控制的相互作用和干扰，其机制还需进一步深入研究。

1.3.2胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor，IGF）IGF与胰岛素高度同源，其中IGF-1具有刺激肌腱细胞有丝分裂和基质合成的作用，可调控细胞增殖和机体生长发育。有研究证实IGF-1可延长肌腱干细胞的多向分化时间，对其增殖和维持表型起到积极的促进作用[17]；IGF-1和TGF-β1联合使用还可诱导间充质干细胞分化为腱细胞，经联合应用处理的韧带结构较单一应用具有更强的最大拉伸负荷能力[18]。而一旦敲除IGF基因，受损的肌肉和肌腱就会呈现出不稳定的愈合反应[19]，这也反向证明IGF-1可促进腱细胞的分化，并提高肌腱的韧性和强度。

1.3.3血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）VEGF能够促进损伤组织的血管新生，通过激活一氧化氮合酶增加毛细血管的通透性[20]。既往研究证明其在腱骨愈合过程中可促进愈合组织的再血管化，提高愈合韧带的强度，且不会增加黏连，但内源性VEGF生成不足，

需要人工补充外源性VEGF以促进腱骨愈合的血管化[21]。但也有研究得出相反的结论，认为VEGF

可侵入内皮细胞引起ECM蛋白水解，从而影响肌腱的愈合[22]；亦有研究表明，VEGF表达与血管密度增加、脂肪浸润、肌肉萎缩呈正相关[23]。目前两种不同的观点均有待进一步的实验证实，同时还需明确VEGF与肌腱血管化之间的量效关系，以便更好地指导外源性VEGF的应用。

1.3.4骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）BMP广泛存在于骨基质中，对骨髓基质干细胞转化为骨细胞、软骨细胞起诱导促进作用。BMP有20多种亚型，目前报道较多的

BMP-2、7、12、13、14均对腱骨愈合过程起促进作用。其中BMP-2是诱导成骨活性最强的BMPs之一，可促进干细胞成骨、成软骨、成脂三向分化，促进血管形成，同时也与肌腱病变中的软骨组织变性、骨组织变性等有关。Schwarting等[24]的系列实验表明，BMP-2和BMP-7均可促进多种目标基因的表达，促使与腱骨愈合相关的碱性磷酸酶、骨钙蛋白等多种指标上调，促进腱骨界面的组织分化，

从而加快腱骨愈合的进程；Kabuto等[25]利用水凝明胶薄膜持续释放BMP-7，使SD大鼠肩袖的腱骨界面在组织学及生物力学性能方面均得到增强。

BMP-14亦被称为软骨源性形态发生蛋白1（cartilage-derived morphogenetic protein-1，CDMP-1）或生长分化因子5（growth differentiation factor 5，GDF-5），既可诱导骨与软骨形成，又能诱导肌腱和韧带形成，同时与细胞增殖及血管新生密切相关。BMP-12（又称GDF-7）仅能诱导干细胞向肌腱或韧带样组织分化，不能诱导骨及软骨形成。运用重组人骨形态发生蛋白-12（rhBMP-12）修复绵羊肩袖损伤，可促进腱骨结合处形成连续胶原纤维，使肌腱最大负荷强度显著提高[26]。Jiang等[27]的研究结果则表明，与对照组及富血小板血浆组相比，局部注射BMP-13（又称GDF-6）能促进肌腱愈合，提高抗张力强度，有效降低再撕裂发生率。

1.3.5 PDGF PDGF是由血小板或平滑肌细胞分泌的碱性多肽因子，由A、B两种亚基通过二硫键结合成 3种异构体——PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB。其能促进腱细胞增殖，促进血管新生及表面信号分子表达，加速肌纤维母细胞产生胶原。PDGF-BB的表达高峰通常出现在腱骨愈合炎症期和修复期的过渡阶段，Tokunaga等[28]的实验证明，PDGF-BB能使大鼠损伤肩袖重新恢复胶原纤维排列，力学性能大为提高，这与既往关于羊肩袖损伤的实验结论类似[29]。以上研究表明，PDGF在解剖形态和力学强度等方面均有助于腱-骨愈合。

亦有研究认为PDGF对腱骨愈合并没有确切的促进和改善作用。Kovacevic等[30]发现，在大鼠肩袖愈合的早期阶段，rhPDGF-BB可促进黏连部位的细胞增殖和血管生成，但晚期对纤维软骨形成或胶原纤维成熟没有任何影响；Würger-Hauri等[31]将PDGF应用于大鼠肩袖损伤修复，胶原纤维排列与对照组并无明显差异；Uggen等[32]亦指出，采用PDGF涂层缝线修复羊冈下肌腱损伤并未改善其力学强度。可见，对于PDGF的生物学作用还需进一步的实验予以证明。

1.3.6 bFGF 又称为FGF-2或FGF-β，由白细胞、肌腱细胞及成纤维细胞等释放产生，主要促进创伤愈合，在腱骨愈合过程中能刺激血管生成，促进成纤维细胞增殖迁移，加速骨、软骨和肌腱的修复。bFGF于肩袖损伤后5～9 d达到高峰，在整个修复过程中均表达为高度上调，有效促进了新血管形成及成纤维细胞增殖[33]。Ide等[34]在大鼠肩袖损伤模型中局部给予bFGF后，明显增强腱骨止点肌腱的成熟度和极限载荷强度。国内外诸多研究均证实，bFGF可刺激腱周血管生成及胶原分泌，促进肌腱愈合，增强肌腱强度，降低肌腱黏连可能[35-36]。

1.4 其他生物因子

粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony stimulating factor，G-CSF）在骨髓中合成，通过直接激活中性粒细胞影响炎症过程，因此促进G-CSF的连续释放可提高肩袖修复的免疫组织学和生物力学性能[37]。结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）参与介导TGF-β1信号通路，是纤维化的共因子[38]，能够通过修改其他生长因子，促进BMP-12在肩袖损伤修复中的致敏作用[39]。肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）可抑制成骨细胞形成，提高破骨细胞活性，同时参与瘢痕形成过程，对腱骨愈合不利。Gulotta等[40]通过动物实验阻断TNF-α，加速了大鼠的腱骨愈合过程。肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）则可促进多种细胞的增殖分化，使腱骨愈合在组织学和力学两个方面强度提高、速度加快[41-42]。

2 信号通路对腱骨愈合的调控作用

在腱骨愈合过程中，生物因子往往是通过信号通路发挥生物学作用的。Wang等[43]在兔ACL重建模型中上调TGF-β的表达水平，进而证实其具有促进ACL愈合的作用，同时发现TGF-β/MAPK信号通路关键蛋白p-ERK1/2、p-p38、p-JNK、c-jun and c-myc也随之表达增加；随后研究人员又通过TGF-β抑制实验，进一步证明了TGF-β/MAPK信号通路在腱骨愈合过程中的调节作用。江华基等[44]利用雄性SD大鼠构建腱骨愈合模型，研究黄芩素对腱骨愈合的促进作用及其机制，结果发现，黄芩素治疗组腱骨愈合强度较对照组显著升高，同时黄芩素可促进WNT/β-catenin信号通路下游关键蛋白β-catenin、Runx2以及OCN蛋白的表达，因此认为黄芩素通过激活WNT/β-catenin信号通路、促进肌腱干细胞的成骨分化，加速了腱骨愈合的过程。张新涛等[45]在骨碎补总黄酮对大鼠腱骨愈合作用的研究中同样发现，骨碎补总黄酮的生物学作用是通过mTOR信号通路实现的，其下游标记蛋白P-S6蛋白表达增加，P-4E/BP1蛋白表达降低，最终促进了成骨相关蛋白Runx2以及OCN蛋白的表达。亦有研究发现COX-2/PGE2是腱骨连接中重要的力学信号通路，力学刺激可通过与PI3K/Akt的共同作用，对肌腱细胞凋亡和腱骨愈合过程进行调控[46]。但目前信号通路的相关研究较少，关键信号通路的具体调节作用仍需进一步明确。

3 腱骨愈合研究的潜在方向——非编码RNA

随着基因技术的发展，骨与软骨的代谢机制研究已经从蛋白、信号通路水平，逐步深入至分子生物水平。遗传信息的传递可以概括为DNA→RNA→蛋白质。其中RNA可以分为编码RNA（也称信使RNA，mRNA）和ncRNA两大类。ncRNA包括长链ncRNA（lncRNA）和微小RNA(miRNA）等，因其未翻译成蛋白质，曾一度被视为垃圾RNA，但越来越多的证据表明，其活跃作用于细胞生物学的各个方面，与生长因子、细胞因子、趋化因子以及炎症、氧化应激和代谢过程密切相关[47-48]。

腱骨愈合中的一系列病理生理过程，如局部炎症反应，血管新生，成纤维细胞增殖，骨、软骨和肌腱韧带组织坏死修复重生等，必然有ncRNA参与其中。Thankam等[49]通过炎症与JAK2/STAT3信号通路研究miRNA表达谱，结果发现235个miRNAs表达改变。Ahn等[50]应用mRNA微阵列分析方法，明确愈合与未愈合肩袖肌腱的遗传差异，结果提示炎症反应基因的下调和细胞分化基因的上调与肩袖愈合有关。Chaudhury等[51]同样采用微阵列技术，试图通过分析研究不同类型肩袖撕裂的基因表达谱，进一步了解病理改变与撕裂大小的关系，结果发现肩袖撕裂后可上调许多关键基因的表达，大、小肩袖撕裂组的基因表达谱与正常对照组差异显著。

尽管外伤不受基因控制，但软骨、肌腱以及韧带的慢性劳损在一定程度上受基因控制，且急慢性损伤的修复均受基因调控。目前关于lncRNA在腱骨愈合中作用的研究相对较少，现有证据表明，lncRNA可通过调节转录来调控下游基因的表达[51]，因此这些基因产物未来可能会成为治疗失败的生物标志物或改善肌腱愈合的治疗靶点，而针对lncRNA及其相关机制的进一步研究，很有可能给腱骨愈合难题带来新的希望。

4 问题及展望

肌腱（韧带）与骨之间的愈合过程受多种因子及信号通路的调控，其机制目前尚未明确。多数生长因子在腱骨愈合过程中具有加速肌腱愈合、改善肌腱力学特性、减少术后肌腱黏连的重要作用。生长因子过多或缺乏都会产生不利影响；病变进展的不同时期需要的生长因子不同，相同因子在不同病变进展时期，所产生的作用也许完全相反。目前的研究报道大多数为一种细胞因子单独应用或两种联合使用，但实际的生理过程是受多种因子共同作用的影响。今后的研究方向之一是联合应用多种生物因子，以发挥最大优势。上游ncRNA对各种细胞因子的调控，以及生长因子对下游信号通路的具体调节作用亦需要进一步明确。我们相信，随着分子生物学技术的不断进步，lncRNA从基因层面对各种细胞因子的调控，将为腱骨愈合过程中细胞因子的研究及其应用打开一扇新的窗户。