高效液相色谱—串联质谱法测定大豆分离蛋白中的三聚氰胺

常晨阳 常凯 朱秀焕 刘伟 韦伟

摘要 本文建立了由高效液相色谱-串联质谱法定量准确、快速检测大豆分离蛋白中三聚氰胺的方法。试样中残留的三聚氰胺经1%三氯乙酸溶液提取，经CX固相萃取柱净化，用超高效液相色谱三重四极杆质谱联用仪进行测定，通过外标法定量。三聚氰胺含量在10～100 ng/mL的范围内与峰面积有良好的线性关系，相关系数为0.999 8，检出限为5 ？滋g/kg。添加水平分别为0.02、0.05、0.10 mg/kg的样品加標回收率为86.7%～101.6%，测定结果的相对标准偏差均小于5%（n=6）。该方法简便、快速、准确、经济，适用于大豆分离蛋白中三聚氰胺的测定。

关键词 液相色谱-串联质谱法；大豆分离蛋白；三聚氰胺

中图分类号 O657.63 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2018）21-0252-02

大豆分离蛋白是以低温脱溶大豆粕为原料生产的一种全价蛋白类食品添加剂[1]，外观呈淡黄色、乳白色粉末状，其蛋白质含量在90%以上，氨基酸种类有近20种，并含有人体必需氨基酸。因其营养丰富，不含胆固醇，是植物蛋白中为数不多的可替代动物蛋白的品种之一。又因其乳化性、水合性、吸油性、凝胶性、发泡性、结膜性等特性，广泛应用在肉类制品、乳制品、面制品及蛋白粉等食品中。随着近年来大豆分离蛋白营养价值的普及，国内外对大豆分离蛋白的需求旺盛，生产企业及生产数量规模化出现量化增长趋势。

三聚氰胺（melamine，C3H6N6），是一种重要的氮杂环有机化工原料，食用三聚氰胺能诱发肾衰竭并导致死亡，是一种禁止用于食品及动物饲料中的化学物质。由于三聚氰胺中氮含量高达66%，较蛋白质氨基酸高 3～4倍，添加三聚氰胺可虚假提高蛋白质含量，降低成本，对人体健康构成威胁[2]。我国在“三鹿”事件发生后将三聚氰胺列入法检目录，要求不得在植物源蛋白类产品中检出三聚氰胺。我国已经制定了多个三聚氰胺检测国家及行业标准[4-6]，其中《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》（GB/T 22388—2008）和《饲料中三聚氰胺的测定》（NY/T 1372—2007）为乳制品检测标准，《植物源产品中三聚氰胺、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺和三聚氰酸的测定 气相色谱-质谱法》（GB/T 22288—2008）虽为植物源产品检测标准，但具体使用范围仅限于小麦粉、玉米粉和大米粉，目前并没有明确适用于大豆分离蛋白的检测标准。笔者基于多年来检测出口大豆分离蛋白产品的经验，建立了采用高效液相色谱质谱法测定大豆分离蛋白中三聚氰胺的方法。该方法准确、快速、经济，且无需经过衍生化处理，适用于大豆分离蛋白中三聚氰胺测定。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

试验仪器有高效液相色谱仪串联三重四级杆质谱仪（日本岛津有限公司LCMS-8040）、电子天平（瑞士梅特勒ME303）、高速离心机（日本日立 CF16RXⅡ）、漩涡混合器（德国IKA MS3 Digital）、氮空吹扫浓缩仪（中国斯帕特 SPT-24）、固相萃取装置（中国楚定DG-24）。

试剂有：乙腈、甲醇，均为色谱纯（美国默克公司）；三聚氰胺标准物质（纯度>99.0%，农业部环境安全监控研究所）；其余化学试剂为分析纯；试验用水为超纯水；CX固相萃取小柱（ACS Retain CX，60 mg/3 mL）。

1.2 标准溶液配制

准确称取0.020 0 g三聚氰胺标准物质，用50%甲醇水溶解定容至100.0 mL容量瓶中，得到200 μg/mL标准储备液；准确移取500 μL标准储备液用流动相10 mmol/L乙酸铵/乙腈（体积比=4∶6）稀释定容至100.0 mL，得到1.0 μg/mL标准中间液，再逐级稀释成浓度为10、20、50、75、100 ng/mL的系列标准工作溶液供LC-MS/MS测定。

1.3 样品处理

称取试样（2.5±0.01）g于50 mL离心管中，加入25 mL 1%三氯乙酸，涡旋混匀，在10 000 r/min条件下离心5 min，经中速定量滤纸过滤后收集滤液于新的50 mL离心管中待净化。预活化固相萃取CX柱（分别用3 mL甲醇和3 mL水活化），加入10 mL上述滤液，后用3 mL水和3 mL甲醇分别洗涤CX柱子，减压抽至近干后用3 mL 5%氨水甲醇溶液洗脱，收集滤液。滤液经氮气吹干后，加入1 mL流动相涡旋混匀，过0.2 μm PTFE滤膜，供LC-MS/MS测定。

1.4 色谱条件

色谱柱为C18柱（岛津Shim-pack GISS 1.9 μm×2.1 mm×100 mm）。流动相为10 mmol/L乙酸铵-乙腈（体积比=4∶6）；流速为0.4 mL/min；进样量为2 μL；柱温为35 ℃。洗脱方式为等度洗脱。

1.5 质谱条件

电喷雾离子源（ESI），正离子模式，多反应监测MRM，干燥气温度为350 ℃，干燥气流速为10 L/min，雾化器压力为344.74 kPa；毛细管电压为3 500 V。三聚氰胺的定性定量离子对、碎裂电压、碰撞能量等参数见表1。

2 结果与分析

2.1 三聚氰胺溶液的配制

三聚氰胺是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，微溶于水，可溶于甲醇，但配制标准溶液时称取的粉末无法在纯水或纯甲醇中溶解，故选择50%甲醇水作为配制储备液的溶剂。之后工作使用液现用现配，使用同液质上机条件的流动相进行逐级稀释。

2.2 前处理过程的优化

2.2.1 提取溶剂的选择和优化。大豆分离蛋白属于高蛋白基质，因而提取溶剂选择了具有蛋白沉淀功能的三氯乙酸和乙酸铅溶液。试验对比了1% 三氯乙酸、3%三氯乙酸，发现高浓度三氯乙酸沉淀蛋白的效果更加明显，但是随着提取溶剂中三氯乙酸含量的增加，对色谱分析中色谱峰形产生较大影响或者有不出峰的现象。引入乙酸铅溶液进行共沉淀，结果发现效果没有显著提升，且有引入重金属的风险，最终选择1%三氯乙酸溶液作为提取溶剂使用。

2.2.2 净化条件的选择。大豆分离蛋白基质呈粉状，在三氯乙酸溶液中形成悬浊液，高速离心后仍有细小轻质悬浮粉末，滤纸过滤后肉眼不可见，这一步对于后续过柱净化尤为重要。未经过滤的上清液会堵住小柱填料筛板，极大地影响过柱时间和回收效率。预活化后的阳离子交换柱CX，上样后，三聚氰胺被吸附在填料上，依次用水和甲醇清洗样品中水溶性杂质、无机盐及非离子化脂溶性杂质。最终使用5%氨水甲醇碱性溶液三聚氰胺洗脱，洗脱效率可达98%以上。

2.3 色谱条件的优化

2.3.1 液相条件的优化。分离三聚氰胺目标物，对比使用了 HILIC、C8、C18色谱柱，由于三聚氰胺属于强极性化合物，其在反相C8 色谱柱上保留效果较差，通过调整优化流动相的构成和比例，最终在常见的C18柱上得到有效保留并分离出峰，避免了亲水性HILIC柱对进样样品高比例有机相的要求，节约了检测成本。本试验利用高效液相色谱仪进行样品分离，故选取适合仪器的岛津Shim-pack GISS 1.9 μm×2.1 mm×100 mm C18色谱柱，可以实现快速分离，在2 min之内就能完成单个样品的检测，大大缩短了檢测时间。在本试验中的流动相，考察了0.1%甲酸水溶液-甲醇、0.1%甲酸水溶液-乙腈、10 mmol/L乙酸铵溶液-甲醇、10 mmol/L乙酸铵溶液-乙腈、10 mmol/L乙酸铵（含0.1%甲酸水）溶液-甲醇和10 mmol/L乙酸铵溶液（含0.1%甲酸水）-乙腈6种流动相组成体系。试验结果发现，10 mmol/L乙酸铵溶液-乙腈（体积比为40∶60）组成等度洗脱能够得到更好的峰形和响应值，因而选择了其作为流动相。三聚氰胺标准溶液的总离子流（TIC）色谱图见图1。

2.3.2 质谱条件的优化。分析发现三聚氰胺的结构，在高能碰撞后容易获得加氢峰，负离子模式响应较差，故在检测中，采用正离子模式检测。首先选择全扫描（SCAN）模式找到三聚氰胺的母离子m/z 127.2，然后选择强度较高的加氢峰m/z 85.2、m/z 68.2作为子离子。通过调整干燥气温度、干燥气流速、雾化器压力、碎裂电压和碰撞能量得到较高的灵敏度，确定最佳的质谱参数。

2.4 线性范围和检出限

在10～100 ng/mL质量浓度范围内以峰面积Y为纵坐标，质量浓度X为横坐标绘制标准工作曲线，得到线性方程为Y=289.588X+1 643.05，r=0.999 8。以信噪比S/N≥3时计算方法的检出限为5 ？滋g/kg，方法灵敏度达到限量检测要求。

2.5 精密度试验

对20 μg/L标准溶液连续6次进样，三聚氰胺保留时间和峰面积的相对标准偏差分别为0.09%和1.32%，仪器精密度良好。

2.6 方法的回收率和精密度

以大豆分离蛋白作为样品，在阴性样品中添加标准溶液的方法进行回收率和精密度测定，分别添加1 μg/mL标准中间液0.050、0.125、0.250 mL，得到添加水平分别为20、50、100 μg/kg的3组样品，分别平行测6次，根据测定结果得到样品中三聚氰胺的加标平均回收率在86.7%～101.6%之间，相对标准偏差小于5%，见表2。因此，本文所建立的方法具有可靠的准确度和精密度。

3 结论与讨论

大豆分离蛋白中的三聚氰胺经1%三氯乙酸溶液提取，经CX固相萃取柱净化，用超高效液相色谱三重四极杆质谱联用仪测定，通过外标法定量。三聚氰胺含量在10～100 ng/mL的范围内与峰面积有良好的线性关系，相关系数为0.999 8，检出限为5 μg/kg。样品加标回收率为86.7%～101.6%，测定结果的相对标准偏差均小于5%（n=6）。该方法简便、快速、经济、准确、高效，能够满足大豆分离蛋白中三聚氰胺的定性和定量检测要求。

4 参考文献

[1] 赵西周，梁少华.国内大豆分离蛋白生产现状与发展建议[J].中国油脂，2012，37（8）：21-24.

[2] 董俏，李曦婷，王文超，等.三聚氰胺致病机理及毒性研究进展[J].家畜生态学报，2015，36（6）：1-4.

[3] 王志豪，杨水平.食品中三聚氰胺的检测技术研究现状[J].广东化工，2016，43（10）：93-94.

[4] 植物源产品中三聚氰胺、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺和三聚氰酸的测定 气相色谱-质谱法：GB/T 22288-2008 [S].北京：中国标准出版社，2008.

[5] 原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法：GB/T 22388-2008[S].北京：中国标准出版社，2008.

[6] 饲料中三聚氰胺的测定：NY/T 1372-2007[S].北京：中国标准出版社，2007.